多功能酶標儀中熒光檢測技術介紹

熒光分析技術是一種強大的分析手段，廣泛地應用在臨(lin) 床檢驗、生物學研究、農(nong) 業(ye) 科學、食品和環境科學中，是多功能酶標儀(yi) 的重要應用。

　　1.概述

　　室溫下，大多數分子處於(yu) 基態的zui低振動能級，處於(yu) 基態的分子吸收能量(光能、化學能、電能或熱能)後躍遷至激發態，激發態不穩定，將很快衰變到基態，以光的形式放出能量，這種現象稱為(wei) “發光現象”。分子發光包括熒光，磷光，化學發光，生物發光等。受到光照時發光，光照切斷時發光立即消失的叫熒光，光照切斷時，發光逐漸變弱以致消失的叫磷光，吸收化學反應的化學能量而發光叫化學發光，由生物能轉變為(wei) 光輻射的稱作生物發光。

　　由於(yu) 發光物質不同熒光有分子熒光和原子熒光之分，分子熒光為(wei) 帶光譜，原子熒光為(wei) 線光譜，通常所說的熒光為(wei) 分子熒光。通過測定所發射熒光的特性和強度，可以對物質進行定性、定量分析。

　　2.熒光檢測技術

　　2.1熒光強度(FI)

　　熒光強度與(yu) 熒光物質的濃度成正比，這是熒光分析法是量分析的依據。在生物學上的應用非常廣泛，可以進行生物大分子定量，酶活性分析，熒光免疫分析，細胞學分析(細胞增殖，細胞毒理，細胞吸附等)和分子間相互作用。

　　2.1.1細胞凋亡檢測

　　Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為(wei) 關(guan) 鍵的執行分子，它在凋亡信號傳(chuan) 導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在於(yu) 胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩(liang) 個(ge) 大亞(ya) 基(17KD)和兩(liang) 個(ge) 小 亞(ya) 基(12KD)組成，裂解相應的胞漿胞核底物，zui終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

　　設計出熒光物質偶聯的短肽Z-DEVD-AMC。在共價(jia) 偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解後釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光(圖1)。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定 caspase-3的活性，從(cong) 而反映Caspase-3被活化的程度。

　　圖1. Caspase-3水解Z-DEVD- AMC

　　2.1.2細胞毒性的檢測

　　體(ti) 外細胞毒性研究對於(yu) 檢測新的生物來源或人工合成的細胞毒素以及例行的臨(lin) 床相關(guan) 的檢測都有著重要的意義(yi) 。細胞膜非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷(shang) 的細胞膜，熒光密度越高反映出其受損細胞越多。

　　2.1.3鈣流檢測

　　Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以靈敏地反映細胞內(nei) 鈣離子濃度的變化，當結合鈣離子時，zui大激發波長會(hui) 發生改變，發射熒光的強度和結合的Ca2+濃度有著定量的關(guan) 係。

　　2.2熒光偏振(FP)

　　1926年Perrin首先描述了熒光偏振理論，溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時，可吸收並釋放出相應的偏振熒光，如果在激發時熒光物質處於(yu) 靜止狀態，發射光將保持原有激發光的偏振性，如果其處於(yu) 運動狀態，發射光電偏振偏振平麵將不同於(yu) 原有激發光的偏振特性，這就是熒光偏振現象，熒光分子與(yu) 其它因子的相互作用，例如相互結合或排斥;其所處環境的性質，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對這個(ge) 熒光因子受激發後發出的發射光的發射平麵產(chan) 生影響。因此以熒光偏振為(wei) 基礎發展的技術可用來研究生命科學中分子之間的相互作用，如受體(ti) 配體(ti) 結合分析，DNA-蛋白質結合分析，SNP分析，酶活性分析。

　　熒光偏振分析所需的樣品量少，靈敏度高，可達亞(ya) 納摩爾級範圍，重複性好，操作簡便，也更為(wei) 安全可靠，不會(hui) 在實驗過程中生成有害的放射性廢物，此外熒光偏振是真正均相的，允許實時檢測(動力學檢測)，對於(yu) 濃度變化不敏感，是均相檢測形式(中間不含洗滌步驟)的*解決(jue) 方案。

　　2.3時間分辨熒光(TRF)

　　在做熒光測定的時候，由於(yu) 背景熒光信號幹擾，使用傳(chuan) 統的發色團進而進行熒光檢測的靈敏度就會(hui) 嚴(yan) 重下降。大部分背景熒光信號是短時存在的，因此使用長衰減壽命的標記物就可以使瞬時熒光幹擾減到zui小化。

　　時間分辨熒光是用稀土元素作為(wei) 標記物，稀土三價(jia) 離子的電子雲(yun) 的結構會(hui) 一定程度上限製了電子的遷移，導致這類元素發生的熒光的衰減周期通常是很長的，從(cong) 而消除背景熒光的幹擾 大大提高檢測的靈敏度(表2)。應用稀土元素作標記物的另一個(ge) 好處是激發光與(yu) 發射光峰值Stoke 位移大。這就可消除激發光和散射光的幹擾，同時, 被激發的熒光光帶極窄, 熒光的發射峰非常尖銳, 可使儀(yi) 器調整在極窄的波長範圍內(nei) 測定, 極大地降低了來自背景的各種幹擾。

　　表2.常見熒光團隊熒光壽命

　　時間分辨熒光靈敏度高、特異性強、穩定性好、標記物製備簡便、檢測重複性好、操作流程短，適用於(yu) 生物學、醫學上的超微量分析，像激素檢測，病毒性肝炎標誌物檢測，靶向細胞的標記檢測以及藥物篩選等方麵。

　　2.4熒光共振能量傳(chuan) 遞(FRET)

　　熒光共振能量傳(chuan) 遞現象是Perrin在20世紀初首先發現的，1948年，Foster創立了理論原理，指熒光能量供體(ti) 與(yu) 受體(ti) 間通過偶極-偶極耦合作用轉移能量的過程，這種能量的轉移是非放射性的，產(chan) 生FRET的條件主要有三個(ge) ：(1)供體(ti) 與(yu) 受體(ti) 間足夠靠近(1～10 nm);(2)供體(ti) 的發射光譜與(yu) 受體(ti) 的激發光譜有一定的重疊;(3)給體(ti) 與(yu) 受體(ti) 的偶一定的空間取向，這是偶極-偶極耦合作用的條件。

　　熒光共振能量傳(chuan) 遞因為(wei) 要考慮到供體(ti) 和受體(ti) 之間的距離，所以經常用來研究分子間的相互作用，像蛋白質的相互作用，抗原抗體(ti) 結合，受體(ti) 與(yu) 配體(ti) 的結合，另外在膜反應、離子通道等方麵的研究也有相應應用。將FRET熒光探針標記的肽鏈，加入到固體(ti) 表麵的雙層膜中，通過熒光漂白恢複(FRAP)成像技術檢測，為(wei) 研究跨膜螺旋二聚作用提供一個(ge) 新的方法。用FRET標記細胞質，應用時間分辨技術，檢測其對P2X離子通道的門控作用。

　　利用Eu等長效熒光物質作為(wei) 供體(ti) ，來進行熒光共振能量傳(chuan) 遞，在激發光熄滅後受體(ti) 仍能較長的能量衰減時間，能量傳(chuan) 遞效率更高，可檢測的相互作用距離更長，可達到100-200nm，時間延遲檢測，降低了背景噪音，提高了靈敏度