液相色譜柱的使用與維護

一、液相色譜柱的基本結構。

  液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環）、篩板（濾片）、接頭、螺絲(si) （封頭）與(yu) 柱填料等組成。

柱管：多用不鏽鋼製成，若果使用時柱壓不高於(yu) 70 kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nei) 壁要求有很高的光潔度。用於(yu) 柱填料的裝填。

壓帽：即色譜柱兩(liang) 端套合於(yu) 柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為(wei) 聚四氟乙烯製成，用於(yu) 固定篩板。

密封環：位於(yu) 接頭螺旋環內(nei) 壁的彈性環，多為(wei) 聚四氟乙烯製成，用於(yu) 色譜柱兩(liang) 端壓帽與(yu) 柱外壁的密封。

    二、色譜柱使用前注意事項。

    色譜柱在使用前，hao進行柱的性能測試，並將結果保存起來，作為(wei) 今後評價(jia) 柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是jia條件)，隻有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由於(yu) 所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

    1、樣品的前處理

    a、hao使用流動相溶解樣品。

    b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與(yu) 柱填料產(chan) 生不可逆吸附的雜質。

    c、使用0.45μm或0.22µm的過濾膜過濾除去微粒雜質。

    2、流動相的配製

    液相色譜是樣品組分在柱填料與(yu) 流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：

    a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(hui) 沉澱在柱中(或長時間保留在柱中)。

    b、流動相與(yu) 樣品不產(chan) 生化學反應

    c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

    d、流動相的物化性質要與(yu) 使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，hao使用對紫外吸收較低的溶劑配製。

    e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chan) 生氣泡，導致實驗無法進行。     

    f、在流動相配製好後，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體(ti) 既有利於(yu) 檢測，還可以防止流動相中的微量氧與(yu) 樣品發生作用。

    3、流動相流速的選擇

    因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對於(yu) 一根特定的色譜柱，要追求jia柱效，hao使用jia流速。對內(nei) 徑為(wei) 4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對於(yu) 內(nei) 徑為(wei) 4.0mm柱，流速0.8ml／min為(wei) 佳。

    當選用jia流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

    注意：

    a．含水流動相hao在實驗前配製，尤其是夏天使用緩衝(chong) 溶液作為(wei) 流動相不要過夜。hao加入die氮化鈉，防止細菌生長。

    b．流動相要求使用0.45 μm或0.22µm濾膜過濾，除去微粒雜質。

    c．使用HPLC級溶劑配製流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

    三、 色譜柱的使用及維護

    1、C18等反相色譜柱使用維護

   色譜柱每次使用時一定不要直接使用含無機鹽的流動相！

A、建議首先使用含有10～30%乙腈或甲醇的高水相（不含鹽）衝(chong) 洗係統及色譜柱30min以上（如用水-有機相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速衝(chong) 洗30min以上），再更換為(wei) 分析流動相。

B、如果流動相中含有緩衝(chong) 鹽，請使用過渡流動相過渡後再換分析流動相平衡；

正確使用緩衝(chong) 鹽，正確使用緩衝(chong) 鹽的目的是防止緩衝(chong) 鹽析出，使用緩衝(chong) 鹽的方法可歸結為(wei) 一句話：使用前要過渡，使用後要衝(chong) 洗。具體(ti) 方法如下：

• 等度條件：使用緩衝鹽前用過渡流動相以1.0mL/min 流速衝洗20-30倍柱體積，然後再使用含有緩衝鹽的流動相；使用後去除緩衝鹽的方法是用過渡流動相以1.0mL/min 流速衝洗30倍柱體積，然後以純有機溶液衝洗30倍柱體積保存。
• 梯度條件：用含有緩衝鹽的流動相進行梯度洗脫之前，用與初始流動相組成相同的過渡流動相以1.0mL/min 流速衝洗30倍柱體積，再開始梯度的運行；分析完成後，再用過渡流動相以1.0mL/min 衝洗色譜柱30倍柱體積，然後以純有機溶液衝洗30倍柱體積保存。

注意：過渡流動相是指有機相和水相比例與(yu) 分析流動相相同比例，隻是不含有緩

衝(chong) 鹽；

阿奇黴素新柱：建議在正常平衡後增加0.1%磷酸/甲醇（90/10）衝(chong) 洗17小時

C、注意事項。

C.1除 AQ外（可耐100%純水），其它反相柱應避免使用純水相，有機相比例建議在5%以上。即使AQ也應避免長時間使用100%水衝(chong) 洗。如果一定要用100%水作為(wei) 流動相，請在酸性條件下使用磷酸鹽緩衝(chong) 液，這樣能延長色譜柱壽命。

C.2請注意色譜柱的pH、壓力耐受範圍，如超出範圍或變化幅度較大會(hui) 引起重現性變差、色譜柱提前劣化等問題。

C.3在有機溶劑含量少、色譜柱溫度高的條件下，耐酸耐堿性能會(hui) 降低。

C.4使用含有離子對試劑等表麵活性劑的流動相，色譜柱的壽命會(hui) 變短。

C.5請使用與(yu) 分析柱相同填料的預柱，否則可能無法得到正常的色譜峰。

C.6.在使用了TFA等強有機酸或堿(pH>8)的流動相之後，請使用與(yu) 所選用的流動相組成相同的有機溶劑和水的混合溶液進行置換。若是一周以上的長期保存，請進一步使用乙腈進行置換，並用附帶的堵頭密封，保存在冷暗處。

C.7通常的衝(chong) 洗可使用高水相-高有機相-有機相（乙腈或甲醇）依次衝(chong) 洗。在甲醇、乙腈衝(chong) 洗過程中，重複注入100～200μl四qi呋喃或異丙醇可有助於(yu) 去除強疏水性物質。

C.8當供試品溶液中含有一定量表麵活性劑，多次進樣後，由於(yu) 表麵活性劑會(hui) 在篩板及矽膠表麵形成表麵膜，導致峰變寬、拖尾甚至分叉。此時，處理方法如下：將色譜柱反向連接接(詢問廠家)，不接檢測器，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速衝(chong) 洗2h以上→再用100%乙腈，以0.6ml/min流速衝(chong) 洗1h以上→然後正向連接好色譜柱，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速衝(chong) 洗1h以上→再用100%乙腈，以1ml/min流速衝(chong) 洗1h以上

2、SCX 氫型陽離子交換柱。

A、每次使用時請一定避免直接使用含無機鹽的流動相，避免鹽析。可使用高水相過渡後再使用分析流動相。（葡jia胺樣品新柱子，用60%乙腈/40水過渡半小時（正常流速即可），後再直接用葡jia胺流動相平衡即可0.2ml流速平衡過液，衝(chong) 洗也一樣先用60%乙腈40水，低流速衝(chong) 半小時，後轉到100乙腈）

B、離子交換柱的平衡時間較反相柱更長，請在分析前保證充分的平衡。

C、.離子交換模式中，洗脫行為(wei) 一般隨以下幾點發生大幅變化：

  ①pH ②鹽濃度 ③有機溶劑量 ④鹽種類

  *為(wei) 了使樣品充分離子化，流動相pHhao與(yu) 樣品的pKa相差 2.0以上

D、短期保存時，請使用含鹽的水係流動相來保存；長期保存時，請用出廠（或谘詢廠家）流動相純乙腈來保存。注意擰緊柱兩(liang) 端自帶堵頭，防止溶劑揮發。

3、NH2色譜柱。

A、每次使用時請注意避免鹽析。

B、弱陰離子交換模式中，一般隨以下幾點洗脫行為(wei) 發生大幅變化：

  ①pH ②鹽濃度 ③有機溶劑量 ④鹽種類

  *為(wei) 了使樣品充分離子化，流動相pHhao與(yu) 樣品的pKa相差 2.0以上

C、HILIC模式中，建議使用乙腈作為(wei) 有機溶液。乙腈量增加，保留能力增大。

D、糖類的分析

 ①請設定乙腈/水的流動相條件。乙腈的濃度越高，則對糖的保留能力越強。

 ②若采用含甲醇或緩衝(chong) 鹽的流動相，峰會(hui) 展寬。

 ③將其他公司矽膠類NH2色譜柱流動相條件中的乙腈含量增加5vol%，使用我公司NH2柱可重現幾乎相同的色譜圖。

 ④若將糖的水溶液作為(wei) 樣品注入，譜峰會(hui) 展寬。請使用含乙腈50%以上的溶劑來配製糖類樣品。

 ⑤曾在酸性條件下使用過的色譜柱，糖類分析的保留時間、峰形會(hui) 發生變化。

E、離子型物質的分析

 ①請設定乙腈/磷酸緩衝(chong) 液且具有一定pH值的流動相條件。

 ②考察流動相條件時，按照pH由高到低的順序進行考察。如果曾經在低pH下使用，填料的表麵將無法回到初始狀態。

 ③有時需要長時間平衡色譜柱(24小時以上)。平衡所需時間與(yu) 通液量和鹽濃度緊密相關(guan) ，因此，時間緊急時請提高流速，或pH不變而增加流動相的鹽濃度來進行平衡。

 ④抗壞血酸的色譜峰有時會(hui) 出現拖尾現象(樣品氧化)。  

F、尿囊素的分析

 尿囊素在pH 2～8範圍內(nei) 未離子化，請使用磷酸緩衝(chong) 液作為(wei) 流動相進行分析。

流動相例：25 mmol/L KH2PO4/ CH3CN = 20 / 80，pH=1.5(H3PO4)

G.一個(ge) 月以內(nei) 的保存，請使用與(yu) 所選用流動相組成相同的有機溶劑和水的混合溶液（不含酸、無機鹽）進行置換，請避免隻用水進行置換；一個(ge) 月以上的長期保存，在進行了上述處理之後，請用出廠時的溶劑（乙腈）置換並保存 

四、 色譜柱的再生

    色譜柱經過一段時間的使用，會(hui) 出現柱壓升高，柱效下降，一種可能是燒結濾片被堵塞；另一種可能是大分子進入柱內(nei) ， 使柱頭被汙染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能是柱頭塌陷，死體(ti) 積增大。您也可嚐試用下麵列舉(ju) 色譜柱再生的方法處理色譜柱。

A、反相色譜柱的再生：

用以下溶劑至少各30mL衝(chong) 洗色譜柱(分析柱)

100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%異丙醇→100%異丙醇→100%二氯甲烷→100%己烷→100%異丙醇→75%乙腈+25% 異丙醇→100%乙腈

*若使用己烷或二氯甲烷衝(chong) 洗色譜柱, 則在重新使用反相流動相以前, 必須用異丙醇衝(chong) 洗色譜柱!!!

• 正相色譜柱的再生

一般情況下 ,極性固定相(如 Si , N H2 , Diol 基色譜填料) 的再生可以依次使用 20～30 倍色譜柱體(ti) 積的正已烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇衝(chong) 洗色譜柱(因異丙醇的粘度較大 ,衝(chong) 洗過程中隨時注意調整衝(chong) 洗流速) ,然後再以相反的溶劑順序衝(chong) 洗色譜柱。