液相色譜法--常見故障排除指南

高效液相色譜 ( HPLC)廣泛應用於(yu) 醫藥衛生、食品安全、環境化學等各個(ge) 領域。在使用過程中難免會(hui) 遇到各種各樣的問題，從(cong) 而影響正常工作，如何快速發現故障、排除故障，並做好預防維護措施及其重要，本文列舉(ju) 了常見故障的排除及解決(jue) 方法，僅(jin) 供大家參考。

故障排除原則

在儀(yi) 器序列運行過程中發生故障時按發現故障、停止儀(yi) 器序列運行、故障信息登記、確認故障來源、解除故障、故障維修登記、做好預防維護措施等步驟進行故障排查及解除故障，在故障排除過程中可遵循以下原則：

原則一：從(cong) 簡單因素入手；
原則二：一次隻變化一個(ge) 因素，利於(yu) 確認因素與(yu) 問題之間的關(guan) 係；
原則三：記錄儀(yi) 器正常狀態的參數及異常狀態信息，完整的記錄是故障排除的關(guan) 鍵步驟；
原則四：做好預防措施，加強儀(yi) 器操作培訓，正確的、良好的操作習(xi) 慣是降低儀(yi) 器故障率的首要條件。

常見故障排除

1、壓力高

壓力偏高或超過壓力上限一般是由方法問題、誤操作、係統堵塞、壓力傳(chuan) 感器故障等問題引起。

方法問題：在方法建立時柱溫、流速等參數建立不當，當使用小粒徑色譜柱或背壓大的色譜柱時，可降低流速或升高柱溫（如35～40℃），以降低係統壓力，該問題多發生在建立方法時。
誤操作：當壓力高於(yu) 平時壓力時首先檢查柱溫是否設置錯誤、流動相溶劑是否使用錯誤（如錯將甲醇用成了粘度高的乙腈）、色譜柱是否拿錯等誤操作。
係統堵塞：排除方法問題及誤操作後，排查是否係統堵塞，進行分段排查，可依次鬆開管路接頭，從(cong) HPLC出口端開始，向上遊泵逐個(ge) 檢查，這是發現堵塞部位簡單的方法，確定堵塞部位後可進行直接更換、或超聲清洗、或反衝(chong) （如六通閥、進樣針、針座、管路等部位），如超聲清洗或反衝(chong) 無效則需更換，經排查是保護柱或色譜柱堵塞時按相關(guan) 方法衝(chong) 洗。

壓力傳(chuan) 感器故障：上述排查後未發現壓力高原因，則需要更換壓力傳(chuan) 感器，聯係儀(yi) 器客服谘詢。
2、壓力低
壓力偏低或無壓力一般是由誤操作、漏夜、泵不輸液等問題引起。
誤操作：泵關(guan) 閉、打開了排空閥等誤操作引起無壓力、柱溫設置錯誤、用錯溶劑、用錯色譜柱等誤操作可能導致壓力偏低或偏高。
漏夜：壓力偏低或無壓力很多時候是由漏夜引起，配有漏夜感應器先確認哪個(ge) 模塊漏夜報錯（此時已經嚴(yan) 重漏夜），清除錯誤後重新啟動泵排查該模塊漏夜位置（用濾紙或紙巾逐個(ge) 接口試漏），未配有漏夜感應器或輕微漏夜時由泵至檢測器逐個(ge) 接口排查（漏夜多發生在色譜柱接口及泵各接口）。確定漏夜位置根據漏夜原因進行處理，如接口鬆動重新擰緊、如密封圈磨損更換密封圈等。
泵不輸液：流動相走空、管路中有空氣、未充分排空、溶劑入口過濾頭堵塞、單向閥汙染均可能引起泵不輸液。首先檢查溶劑瓶內(nei) 是否有溶劑、管路中是否充滿氣體(ti) ，進行排空（如排空廢液口無液體(ti) 流出使用注射器手動抽，至有連續液體(ti) 流出）；排空後依然無壓力、壓力偏低或壓力波動，且廢液口無廢液流出，超聲清洗單向閥或更換單向閥，無改善將溶劑入口過濾頭取下，查看壓力是否正常，如濾頭堵塞超聲清洗或更換（注：安捷倫(lun) 溶劑入口過濾頭為(wei) 陶瓷材質，不可以超聲，使用1%～10%硝酸浸泡過夜）。
3、壓力波動
排氣不充分或未排氣、脫氣機未開或故障、流動相中溶劑不互溶或易揮發、溶劑入口過濾頭部分堵塞、單向閥汙染、漏夜等均可導致壓力波動。
排空不充分或未排空：發現壓力波動首先進行流動相排空，一般排空後壓力正常。
脫氣機未開或故障：外置脫氣機檢查電源是否打開或報錯（如安捷倫(lun) 1100、1200，島津20AT、20AD為(wei) 外置脫氣機）；內(nei) 置脫氣機檢查泵是否有報錯信息（如安捷倫(lun) 1260等為(wei) 內(nei) 置脫氣機）；waters e2695為(wei) 內(nei) 置脫氣機在控製麵板可以控製脫氣機開關(guan) ，需檢查開關(guan) 是否打開，壓力是否小於(yu) 1psi。
流動相中溶劑不互溶或易揮發：檢查緩衝(chong) 鹽稱量是否正確、是否混合均勻，檢查溶劑是否互溶。
溶劑入口過濾頭部分堵塞：查看溶劑入口過濾頭周圍是否有大量氣泡，如果有大量氣泡可能過濾頭較髒，超聲清洗，安捷倫(lun) 陶瓷濾頭用久了會(hui) 變黑，取下1%～10%硝酸浸泡過夜。
單向閥汙染：如排空後壓力波動依然較大，取下單向閥超聲清洗，多數情況可以解決(jue) 。
漏夜：多數為(wei) 柱塞杆密封圈磨損導致漏液，配有在線清洗時檢查在線清洗液是否有明顯增加（清洗液循環使用的），查看在線清洗管路出口端，在未清洗時是否有液體(ti) 緩慢流出，如有液體(ti) 流出說明，柱塞杆密封圈磨損導致漏液，更換密封圈或柱塞杆及密封圈。
4、保留時間變動
如果所有峰（色譜峰）的保留時間均發生了變化，其原因很可能是流動相的組成、色譜柱的化學性質、色譜柱的溫度或流速、在線混合時比例閥故障等。
流動相的組成：如果操作人員操作不當，則會(hui) 導致流動相組成的意外變化，例如使用在線式混合係統時，流動相混合物（係統）設置不正確；或替換新批次流動相時，未妥善製備新的流動相（新流動相配製不正確）。在極少數情況下，會(hui) 出現流動相組分選擇性損失的情況，例如蒸發。
當流動相發生變化時，峰形（色譜峰）通常會(hui) 向相同的方向移動，以縮短或延長保留時間（保留時間變長或變短）；而相對保留通常會(hui) 發生變化。檢查流動相組成錯誤的較佳方法是仔細檢查（複查）係統設置；如有必要，應製備新的流動相。
如果您懷疑設備出現故障，請將色譜柱和流動相移至另一個(ge) HPLC係統，然後再次運行。如果問題依然存在，則問題在於(yu) 流動相或色譜柱；如果問題不再出現，則可能與(yu) 儀(yi) 器硬件故障或參數相關(guan) 。
色譜柱化學（化學性質）變化：一般會(hui) 在色譜柱使用數周或數月內(nei) 逐漸變化。柱老化一般伴隨著柱背壓的上升、保留時間的逐漸變化（漂移）（更長或更短）以及更多的峰拖尾。更換新柱以確定是否是柱老化導致的保留時間變動。
色譜柱溫度變化：柱溫變化會(hui) 導致保留時間的變化，每1℃的溫度變化會(hui) 引起1-3％的保留時間變化。如果不使用柱溫箱（即“室溫”條件），實驗室溫度通常會(hui) 變化。尤其是當供暖或空調通風口直接吹向係統時，溫度變化極為(wei) 明顯。使用柱溫箱可以避免色譜柱出現這樣的溫度問題，且HPLC係統應遠離通風口放置。
流速變化：可能是因存在氣泡、泄漏或泵問題（故障）導致流速與(yu) 設定值發生變化，導致保留時間變化。
氣泡問題：可能伴有柱壓過低或柱壓波動，且保留時間延長。對於(yu) 雙頭泵，如果隻有一個(ge) 泵頭存在氣泡，則流量和壓力可能會(hui) 發生脈動。
泄漏也會(hui) 延長保留時間。查看接頭如有液滴或結晶析出，可證明有泄露。請特別注意色譜柱之前的接頭。如果使用不鏽鋼配件，通常將接頭螺母手動擰緊，再扳手擰緊1/4圈，便可以阻止泄漏。使用PEEK接頭時，應停止泵，鬆開接頭，將管路推到接口端口的底部，再擰緊接頭。擰緊PEEK接頭時如果存在流動的液體(ti) ，會(hui) 導致管道在配件中滑動，產(chan) 生柱外死體(ti) 積，進而影響分離效果。
單向閥汙染或泵密圈磨損會(hui) 導致流量偏低或波動，從(cong) 而導致保留時間變化。單向閥汙染可以進行超聲清洗，隨著使用時間的增加，泵密封圈會(hui) 出現磨損，而且使用高濃度緩衝(chong) 鹽為(wei) 流動相，會(hui) 縮短泵密圈的使用壽命，可以根據使用情況及密封圈故障率定期更換密封圈，通常一年更換一次即可。
比例閥和在線混合發生故障會(hui) 降低梯度洗脫的效果，從(cong) 而導致保留時間變化，下麵介紹了一種檢查流動相配比精度的簡單方法：將色譜柱柱更換為(wei) 0.005英寸直徑約1米長（0.12mm）的管道，流動相A為(wei) 水，流動相B為(wei) 0.1％丙酮的水，檢測器波長設置為(wei) 265nm，並使用足夠高的流速使單向閥能夠有效工作（例如2mL/min）。以10％為(wei) 增量進行梯度變化（如流動相B由10％、20％、30％……90％至100％）。其結果應是平滑的階梯狀。
5、峰形問題
峰形常見問題有拖尾峰、伸舌峰、分叉峰、鬼峰等。
拖尾峰：
（1）堿性化合物與(yu) 矽膠顆粒表麵上的酸性或離子化矽烷醇基團之間相互作用而導致拖尾，選擇經封端處理的色譜柱、添加掃尾劑如三乙胺，可以改善拖尾。
（2）緩衝(chong) 液或離子對試劑濃度低也會(hui) 導致峰拖尾，緩衝(chong) 液主要用來使樣品保持恒定的離子化狀態，從(cong) 而穩定保留時間，並在較大程度上減少因離子相互作用而導致的峰拖尾現象。緩衝(chong) 液和離子對試劑的一個(ge) 共同特征是作用效果（例如峰拖尾的減少、保留時間的穩定）會(hui) 從(cong) 低濃度開始顯現，並隨著濃度的增加而繼續作用增加，但會(hui) 逐漸維持在一個(ge) 穩定水平。穩定水平之下的緩衝(chong) 鹽或離子對濃度，可以保持穩定的運行；濃度過高可能導致溶解性問題，新藥特別注意。
（3）柱篩板堵塞引起峰拖尾或變形：柱篩板堵塞會(hui) 影響樣品在色譜柱入口端的分流，使得部分樣品通過不同的流動路徑到達色譜柱，因此會(hui) 晚於(yu) 另一部分樣品。由於(yu) 此時未發生分離，因此所有分析物會(hui) 以相同的方式變形（被擾亂(luan) ），進而色譜圖顯示所有峰均具有相似（類似）的峰拖尾或變形。
（4）死體(ti) 積過大：當相同方法轉移至其它儀(yi) 器時出現色譜圖中所有峰拖尾或變形可以排查是否死體(ti) 積增大導致，管路長度、內(nei) 徑、接口處是否擰緊均可改變死體(ti) 積。
伸舌峰（前拖峰）：
伸舌峰一般是由柱過載、柱結構塌陷、接口處死體(ti) 積渦流、樣品溶劑與(yu) 流動相不兼容、柱溫低等因素導致的。柱過窄、樣品溶劑與(yu) 流動相不兼容、柱溫低等因素產(chan) 生的伸舌峰一般發生在方法開發期間，需要篩選適合的柱溫、稀釋劑及進樣濃度；穩定的方法忽然出現伸舌峰需要排查色譜柱是否塌陷及管路接口處是否對接緊密，特別注意色譜柱接口處，接口處的死體(ti) 積容易產(chan) 生渦流，導致伸舌峰。

分叉峰：

（1）色譜柱或保護柱入口端汙染：如安裝保護柱可不接保護柱或更換新的保護柱來排除，再更換新的色譜柱進行排除，確認是色譜柱汙染，進行衝(chong) 洗，衝(chong) 洗無效，對色譜柱進行再生或更換色譜柱。
（2）篩板堵塞：關(guan) 注色譜柱壓力，如高於(yu) 之前的壓力，可能篩板堵塞，反衝(chong) 色譜柱或更換色譜柱排查。
（3）樣品稀釋劑與(yu) 流動相不兼容：在方法開發其間出現分叉峰時需要排查稀釋劑與(yu) 流動相的兼容性，建議選擇流動相作為(wei) 稀釋劑，在日常檢測中需要排查是否用錯稀釋劑。
（4）幹擾峰：可能是樣品中純在的物質與(yu) 目標物為(wei) 分離，需要調節方法（調節流動相或更換色譜柱）改變選擇性，可能是係統中引入的汙染物，通過空白溶液可以排查。
（5）色譜柱過載：選擇高容量的色譜柱或降低進樣濃度。

鬼峰：主要來源於(yu) 溶劑汙染（包括流動相、稀釋劑等）、色譜柱汙染、進樣器汙染、氣泡、配樣汙染（移液、定容等過程）、上針殘留等，如鬼峰出現在空白溶液，且多針重現，可通過進空針、更換洗針液、更換色譜柱、更換儀(yi) 器、重配流動相等篩選引起鬼峰位置；如鬼峰出現在樣品溶液中，可能是上針殘留、氣泡、及配樣汙染。