顯微鏡分辨率：概念、因素和計算

在顯微鏡學中，‘分辨率’一詞用於(yu) 闡述顯微鏡對細節進行區分的能力。換言之，這是樣本內(nei) 兩(liang) 個(ge) 能被觀察人員或者顯微鏡攝像頭區分的實體(ti) 點之間的理想的距離。

顯微鏡的分辨率本質上與(yu) 光學元件的數值孔徑（NA）以及用於(yu) 觀察樣本標本的光波長有關(guan) 。此外，我們(men) 必須考慮Ernst Abbe於(yu) 1873年提出的衍射極限。

本文章包含了這些概念的曆史介紹並使用相對簡單的術語對其進行了解釋。

分辨率與(yu) 數值孔徑

數值孔徑（NA）與(yu) 光通過的介質的折射率（n）以及給定物鏡的孔徑角（α）有關(guan) （NA=n × sin α）。顯微鏡的分辨率不僅(jin) 取決(jue) 於(yu) 物鏡的NA，還取決(jue) 於(yu) 整個(ge) 係統的NA，要把顯微鏡聚光鏡的NA也納入考慮。在顯微鏡係統中，所有光學元件都正確對齊、具有相對較高的NA值並且相互協調工作，可以分辨出更多的圖像細節。分辨率還與(yu) 標本成像所用的光波長有關(guan) ；波長越短，可分辨的細節越多，波長越長則分辨細節越少。

在處理分辨率時需要考慮三個(ge) 數學概念：‘阿貝衍射極限’、‘艾裏斑’和‘瑞利判據’。以下按時間順序逐一介紹。

George Biddell Airy與(yu) ‘艾裏斑’（1835）

George Biddell Airy（1801-1892）是英國數學家和天文學家。1826年，25歲的他被任命為(wei) 三一學院的數學教授，兩(liang) 年後，被任命為(wei) 新劍橋天文台的天文學教授。1835年到1881年期間，他是“天文學家"，月球和火星上各有一處以他的名字命名的隕石坑。

1835年，他在劍橋哲學學會(hui) 學報上發表了一篇題為(wei) 《有關(guan) 圓孔徑物鏡的衍射》的論文。Airy在論文中以一個(ge) 天文學家的視角描述了通過一個(ge) 精良的望遠鏡觀察到的恒星周圍的光環或者射線的形狀及亮度。盡管是從(cong) 不同的科學領域發表的文章，但這些觀察結果與(yu) 其他光學係統，特別是顯微鏡存在著關(guan) 聯。

艾裏斑(Airy Disc)是在衍射限製的係統中由圓形孔徑形成的聚焦的光點。如圖1所示，其呈現為(wei) 中央亮點和周圍是明暗相間的同心環（更準確地說，這是艾裏圖案Airy pattern）。

衍射圖案由光的波長和光所通過的孔徑大小決(jue) 定。艾裏斑的中心點含有大約84%的光強，其餘(yu) 16%分布於(yu) 環繞該點的衍射圖案中。當然，用顯微鏡進行觀察時標本上會(hui) 有許多光點，因此基於(yu) 大量的艾裏圖案來考慮，而非如“艾裏斑"描述的單個(ge) 光點來考慮是更妥當的方式。

圖1右所示的艾裏圖案三維表示又稱為(wei) ‘點擴散函數’。

圖1：艾裏圖案，或稱艾裏斑的典型現象，由其中心的理想的光點和環繞的衍射環組成。

Ernst Abbe與(yu) ‘Abbe衍射極限’（1873）

Ernst Karl Abbe（1840-1905）是一位德國數學家和物理學家。他與(yu) Carl Zeiss共同創立了“蔡司光學工作室"即現在的蔡司公司。除此之外，他還在1884年聯合創辦了Schott Glassworks。Abbe還是定義(yi) 數值孔徑這一術語的一位學者。1873年，Abbe發表了自己的理論和公式對顯微鏡的衍射極限進行了解釋。Abbe發現，標本圖像由許多重疊的、多強度且存在衍射極限的點（或艾裏斑）所組成。

要提高分辨率（d=λ/2 NA），標本必須使用波長（λ）更短的光來進行觀察，或者通過折射率相對高的成像介質來進行觀察，又或者使用NA較高的光學組件來進行觀察（或者將全部3種因素組合起來）。

但即便將所有這些因素都考慮在內(nei) ，顯微鏡係統的極限依然受到限製，因為(wei) 係統複雜性，波長低於(yu) 400 nm的光在玻璃中的傳(chuan) 播特征，以及整套顯微鏡需要達到較高的NA。理想光學顯微鏡的橫向分辨率限製在200 nm左右，而軸向分辨率約為(wei) 500 nm（有關(guan) 分辨率極限示例，請參見下文）。

John William Strutt與(yu) ‘瑞利判據’（1896）

第三代瑞利男爵John William Strutt（1842-1919）是一名英國物理學家，也是一位高產(chan) 學者。他一生編寫(xie) 了多達466篇論文，包括430 篇科研論文。他的論文涉獵極廣，各種主題都有，如鳥類飛行、心理研究、聲學等等。1895年，他發現了氬並憑借這一發現於(yu) 1904年獲得諾貝爾獎。

Rayleigh以George Airy的理論為(wei) 基礎上並進一步延伸，於(yu) 1896年創造了“瑞利判據"理論(Rayleigh Criterion)。瑞利判據（圖2）在衍射極限係統當中定義(yi) 了分辨率極限，換言之，就是何時能夠將2個(ge) 光點相互區分或分辨。

使用艾裏斑理論，如果2個(ge) 單獨艾裏斑的衍射圖案不重疊，則就可以輕鬆區分、‘分辨’兩(liang) 者並認定滿足瑞利判據（圖2，左圖）。而當艾裏斑的中心直接重疊於(yu) 另一個(ge) 艾裏斑的第一理想的衍射圖案時，則兩(liang) 者認定為(wei) ‘剛好分辨’，同時依然可以區分為(wei) 2個(ge) 獨立的光點（圖2，中圖）。如果艾裏斑再繼續相互接近，則兩(liang) 者無法滿足瑞利判據，因此“無法被分辨"為(wei) 2個(ge) 不同的光點（或者標本圖像中的單獨細節；圖2，右圖）。

圖2：分辨率極限（按瑞利判據來定義(yi) ），兩(liang) 個(ge) 單獨艾裏斑的重疊衍射圖案：左圖：分辨良好；中圖：剛好分辨；右圖：未分辨

如何計算顯微鏡的分辨率

將以上全部理論都考慮在內(nei) 就可以明顯看出，在計算分辨率的理論極*需要考慮很多因素。分辨率還取決(jue) 於(yu) 樣本性質。我們(men) 來看一下使用阿貝衍射極限以及使用瑞利判據進行的分辨率計算。

首先應當要牢記：

NA= n x sin α

式中n為(wei) 成像介質的折射率，α是物鏡孔徑角的一半。物鏡的理想的孔徑角大約為(wei) 144º。該角度一半的正弦為(wei) 0.95。如果使用油浸物鏡且折射率為(wei) 1.52，則物鏡的理想的NA為(wei) 1.45。如果使用‘幹式’（無浸沒）物鏡，則物鏡理想的NA為(wei) 0.95（因為(wei) 空氣的折射率為(wei) 1.0）。

橫向（即XY）分辨率的阿貝衍射公式為(wei) ：

d= λ/2 NA

式中λ 是標本成像所用的光波長。如果使用514 nm的綠光及NA為(wei) 1.45的油浸物鏡，則分辨率的（理論）極限將達到177 nm。

軸向（即Z）分辨率的阿貝衍射公式為(wei) ：

d= 2 λ/NA2

同樣的，如果我們(men) 假設通過波長514 nm的光來觀察標本且物鏡NA數值為(wei) 1.45，則軸向分辨率為(wei) 488 nm。

在阿貝衍射極限的基礎上，瑞利判據稍稍得到了細化：

R= 1.22 λ/NAobj+NAcond

式中λ為(wei) 標本成像用的光波長。NAobj 為(wei) 物鏡NA。NAcond為(wei) 聚光鏡NA。‘1.22’是一個(ge) 常係數。該數值根據Rayleigh的貝塞爾函數研究推導得出。這些主要用於(yu) 對係統當中的問題，例如波的傳(chuan) 遞，進行計算。

將聚光鏡的NA考慮在內(nei) ，空氣（折射率為(wei) 1.0）通常是聚光鏡和玻片之前的成像介質。假設聚光鏡的孔徑角為(wei) 144º，則NAcond數值將等於(yu) 0.95。

如果使用514 nm的綠光，油浸物鏡的NA為(wei) 1.45，聚光鏡的NA為(wei) 0.95，則分辨率的（理論）極限將達到261 nm。

如上所述，用於(yu) 對標本成像的光波長越短，可以分辨的細節越多。因此如果使用400 nm的理想的可見光波長，油浸物鏡NA為(wei) 1.45，聚光鏡NA為(wei) 0.95，則R等於(yu) 203 nm。

要在顯微鏡係統當中達到（理論）分辨率的理想值，每個(ge) 光學組件都應當具備理想的可用的NA（把孔徑角納入考慮）。此外，觀察標本所用的光波長越短則分辨率越高。最後，整個(ge) 顯微鏡係統都應當準直對齊。