用於病毒複製研究的正置熒光顯微鏡

用於(yu) 病毒複製研究的正置熒光顯微鏡
冠狀病毒2致重度急性呼吸綜合征(SARS-CoV-2)出現於(yu) 2019年末，並快速傳(chuan) 播全球。由於(yu) 其大麵積的影響，研究人員對病毒的性質進行了深入的研究以期最終阻止大流行。一個(ge) 重要的方麵是病毒如何在宿主細胞中複製。Ogando及其同事的研究已經揭示了SARS-CoV-2的複製動力學、適應能力和細胞病理學。他們(men) 的工具之一是用熒光顯微鏡觀察SARS-CoV-2感染的VeroE6細胞。通過使用前一段時間產(chan) 生的抗SARS-CoV（2002）的抗體(ti) ，他們(men) 發現了與(yu) SARS-CoV-2的強烈交叉反應。因此，他們(men) 建立了一種通過免疫熒光顯微成像研究SARS-CoV-2複製的工具。

   
用於(yu) 病毒觀察的顯微鏡
病毒可以借助幾種顯微鏡技術進行研究。根據顯微鏡的放大倍數和分辨率，可以在組織水平、細胞水平或病毒粒子水平進行觀察（圖1）。通常，病毒粒子本身隻能通過電子顯微鏡或超分辨顯微鏡來分辨。在細胞水平上，病毒大多借助先進的寬場熒光或共焦顯微鏡進行觀察。在組織中，明場顯微鏡或基本的寬場熒光顯微鏡足以用於(yu) 病毒研究。但是顯微技術的鑒別並不是嚴(yan) 格的。

光學數字圖像處理工具如ICC光學圖像解析等可以幫助提高背景信號比，減少離焦模糊。相關(guan) 的對比度增強可以揭示顯微圖像中的附加信息。



圖1: 病毒可從(cong) 組織到單個(ge) 病毒顆粒的不同層麵進行觀察。對於(yu) 這種方法，需要明顯的放大倍數和分辨率。因此，研究人員選擇了一種適合他們(men) 需要的顯微鏡技術。

病毒蛋白的免疫熒光檢查
在測序技術、生物信息學和電子顯微鏡中，Ogando等人通過熒光顯微鏡分析了感染細胞：VeroE6細胞生長在玻璃蓋玻片上，感染SARS-CoV-2，並用多聚甲醛固定。然後，用事先暴露於(yu) SARS-CoV的兔子或小鼠的抗血清孵育細胞（圖2）。用熒光標示的二級抗體(ti) 檢測與(yu) veroe6細胞SARS-CoV-2結構結合的SARS-CoV源性抗體(ti) 。此外，細胞核用Hoechst染色。用DM6 B直立熒光顯微鏡進行熒光成像。



圖2: Ogando等人的一項實驗涉及使用免疫熒光顯微鏡對VeroE6細胞成像。在2002/2003年SARS爆發期間，他們(men) 大體(ti) 上探索了在兔子身上製備抗SARS-CoV抗血清的潛力。他們(men) 使用不同的兔抗血清作為(wei) 第一組抗體(ti) 。然後，用第二組熒光抗體(ti) 標記這些兔抗血清。隨後，用DM6 B顯微鏡進行熒光顯微鏡檢查。
SARS-CoV抗血清與(yu) SARS-CoV-2的交叉反應

免疫熒光顯微鏡顯示，許多SARS-CoV抗血清在SAR-SCoV-2感染細胞（病毒蛋白nsp3、nsp4、nsp5、nsp8、nsp9、nsp13、nsp15、N、M）中具有交叉反應性。這一事實意味著，針對SARS-CoV產(chan) 生的抗血清也導致SARS-CoV-2感染細胞的特征性熒光染色（圖3）。nsps出現在感染細胞的核周區，而N蛋白則分布在胞漿中。在高爾基體(ti) 中檢測到M蛋白。



圖3: SARS-CoV-2感染VeroE6細胞後用兔SARS-CoV抗血清處理的免疫熒光顯微鏡。Nsps位於(yu) 細胞核附近，M蛋白位於(yu) 高爾基體(ti) 。抗dsRNA抗體(ti) 用於(yu) 標記病毒RNA合成的複製中間產(chan) 物。細胞核用Hoechst染色。（a）和（b）的比例尺為(wei) 25 μm；（c）、（d）和（e）的比例尺為(wei) 100 μm。圖片來源：Ogando et al., Journal of General Virology (DOI 10.1099/jgv.0.001453)。

正置熒光顯微鏡在病毒學研究中的潛力
Ogando等人的研究中描述的交叉反應抗血清將是特征性SARS-CoV-2複製周期的實用工具。這個(ge) 工具反過來能使研究人員能夠確定複製抑製劑的潛在目標。

一個(ge) 相對簡單的實驗裝置-免疫熒光顯微鏡-足以得出病毒複製周期的結論。因為(wei) 這種方法細胞生長在蓋玻片上，並安裝在玻片上，所以正置熒光顯微鏡是一種實用的解決(jue) 方案。配備有電動載物台和采用寬視野（FOV）的自動化掃片模塊幫助用戶快速獲取全玻片的圖像概覽。如果單視野快拍就能滿足需求，則機械式載物台是更合理的選擇。