如何使用熒光顯微鏡觀察細胞

免疫熒光
IF是一種通過熒光基團標記檢測細胞內(nei) 有機分子，胞內(nei) 定位及其相互作用關(guan) 係的成像研究手段。IF製劑可通過多種顯微鏡技術（如激光共聚焦、寬場熒光、全內(nei) 反射成像等）來加以分析，具體(ti) 取決(jue) 於(yu) 應用目的或研究人員的關(guan) 注重點。與(yu) 此同時，在很多使用至少一套簡易熒光顯微鏡的研究工作組當中，IF早已成為(wei) *的一部分。
IF實驗的核心部分是兩(liang) 種不同組分的組合：

• 首先是特異性抗體(ti) ，用於(yu) 形成免疫複合物來標記細胞內(nei) 需要研究的分子，大多數情況下為(wei) 蛋白質。

• 其次是熒光色素，與(yu) 免疫複合物耦合，可以利用顯微鏡進行觀察目標結構。

圖1：圖中顯示了間接免疫熒光的典型工作流程，上皮細胞粘附在蓋玻片上生長。培養(yang) 後細胞被固定，因此用化學交聯劑（如甲醛）將其殺死。再用清潔劑進行透化處理，使抗體(ti) 穿過細胞膜。用正常血清、奶粉或牛血清白蛋白來進行封閉，可減少抗體(ti) 與(yu) 非靶向結構的非特異性結合，從(cong) 而減少假陽性信號。接下來與(yu) 一抗進行孵育，特異性識別靶向分子上的表位。在第二個(ge) 培育步驟中，應用熒光耦合二抗，與(yu) 一抗結合來實現靶向結構的可視化觀察。抗體(ti) 孵育後，用DAPI或Hoechst等嵌入DNA的染料進行細胞核染色。在顯微鏡載玻片上塗有封固介質（例如Mowiol或Prolong Gold）的蓋玻片後，IF即已準備好進行顯微鏡觀察。

直接與(yu) 間接免疫熒光
根據實驗類型的不同，有兩(liang) 種不同的IF變體(ti) 可以使用：第一種是直接IF或一級IF，一種具有特異性的一抗，能夠與(yu) 熒光色素連接用於(yu) 結合靶向結構並實現直接可視化觀察。
第二種變體(ti) 是指間接或二級IF，這種變體(ti) 需要采用兩(liang) 步式培育。首先，特異性一抗識別靶向結構。然後應用與(yu) 一抗特異結合的熒光色素耦合二抗。這種特異性是通過引導二抗抵禦產(chan) 生一抗的物種而獲得的（見‘抗體(ti) 和熒光色素’章節）。比較兩(liang) 種IF變體(ti) 可見兩(liang) 者各有不同的優(you) 缺點：
通過耦合一抗和熒光色素，耗時的清洗和培育步驟被省略，所以直接IF比間接IF更快。因此，直接IF更易於(yu) 處理，適合於(yu) 在標準IF實驗中（例如在臨(lin) 床實踐中）對樣本進行快速分析。但必須使用一種功能良好且對其抗原高度敏感的一抗。這同時也是一個(ge) 缺點，因為(wei) 熒光耦合和驗證的一抗成本較為(wei) 高昂。此外，每個(ge) 靶向結構都需要一個(ge) 單獨的一抗，與(yu) 間接IF相比，抗體(ti) 與(yu) 直接IF中的熒光色素的連接限製了設計實驗的靈活性。
這種靈活性是間接IF的顯著優(you) 勢之一。通常在IF反應過程中，同一樣本都會(hui) 有幾個(ge) 不同的靶結構需要實現可視化觀察，因此必須為(wei) 每個(ge) 靶向分子選擇一個(ge) 離散的熒光色素。
在間接IF中，不同的熒光耦合二抗可以與(yu) 不同的一抗結合（當然還要考慮到物種的反應性）。相較之下，如果想在直接IF中對靶向結構“玩"顏色組合，則需要為(wei) 每一種顏色使用單獨的一抗。間接熒光的另一個(ge) 優(you) 點是二抗的信號放大。多個(ge) 二抗分子可與(yu) 一個(ge) 一抗結合來實現熒光增強，這意味可減少使用一抗。
間接IF的工作流程可能需要花費更多時間，但由於(yu) 一抗和二抗能夠組合而且整個(ge) 操作過程的經濟性更高，因此間接熒光成為(wei) 了絕大多數研究人員的首要選擇方法。

圖2：有兩(liang) 種方法通過免疫熒光顯示靶向結構：在兩(liang) 種變體(ti) 中，一種特異的一抗用於(yu) 識別靶分子上的特定表位。在此圖中，目標分子由幾個(ge) 相同的蛋白質亞(ya) 單位（=大分子）組成，因此會(hui) 在每個(ge) 亞(ya) 單位上表現出幾個(ge) 相同類型的表位。為(wei) 方便簡化，此處隻描繪了一個(ge) 表位。

直接IF中，一抗直接連接到熒光色素，在顯微鏡下觀察靶向結構。間接IF中，熒光耦合二抗在第二培育步驟中使用，從(cong) 而專(zhuan) 門對一抗進行標記。因為(wei) 多個(ge) 二抗分子可以結合到一個(ge) 一抗上，所以選擇抗體(ti) 和熒光色素的靈活性更大，並能夠進一步放大信號。

抗體(ti) 與(yu) 熒光色素

高質量的IF染色當中，最重要的工具是良好的一抗。同時，幾乎每種細胞類型中的每種蛋白質都有一種或幾種市售抗體(ti) 。但此處需要強調若幹重要注意事項。
要根據IF染色來做出精確的科學或臨(lin) 床聲明，就必須確保一抗對其目標抗原的特異性。在操作中，研究人員不應*依賴商業(ye) 供應商的說明。應根據之前的使用經驗以及文獻中確認有效的一抗來進行抗體(ti) 選擇。查看製造商網站上的抗體(ti) 數據表，查看IF染色的可用圖片並與(yu) 自身期望相比較，或者與(yu) 其他已發布的插圖進行比較。注意抗體(ti) 的克隆號，因為(wei) 單克隆抗體(ti) 隻與(yu) 一個(ge) 表位特異性結合，而多克隆抗體(ti) 可識別多個(ge) 表位，因此有可能存在非靶向結構的非特異性標記。所以，特異性較高且性能較優(you) 的單克隆抗體(ti) 通常更昂貴，但也能獲得更好的效果。
如希望開展多色間接IF實驗，則不同的一抗必須衍生自不同的物種，以便在之後通過熒光耦合二抗來區分免疫複合體(ti) （見表1）。比如，您希望使用小鼠衍生的抗體(ti) 抗蛋白A、兔衍生的抗體(ti) 抗蛋白B和大鼠衍生的抗體(ti) 抗蛋白C來實施IF檢查。在選擇二抗時必須記住，每種抗體(ti) 都隻能特定識別一種一抗。此外，在這三種二抗的例子中，熒光色素的波長光譜必須不同，以便在顯微鏡分析中辨別熒光信號。如今，可以買(mai) 到與(yu) 熒光色素相連的二抗，其波長範圍從(cong) 紫外線到紅外線，幾乎可以針對任何物種的一抗。因此，研究人員目前僅(jin) 受到現有顯微鏡（濾光片組、激發激光器）配置的限製。利用新型的激光器，可以擴展紅外一區的信號（圖一、二）。

表1：此處的多色間接IF示例演示了如何在同一個(ge) 細胞中同時標記三種不同的蛋白質。三種蛋白質的一抗必須來自不同的物種，以便用三種不同的熒光色素耦合二抗來進行檢測。二抗的熒光色素必須在波長光譜上有所區分才能在顯微鏡下進行不同的分析。

圖一 常見熒光蛋白和熒光素的發射光譜

圖二 在近紅外一區，利用新型熒光標記可以獲得更多信號。Cos-7細胞圖像，使用SiR-Actin（657 – 740nm探測範圍）、AF750-Tom20（760 – 790nm）、AF790-Tubulin（810 – 850nm）標記。樣本由蘇黎世大學的Jana Döhner和Urs Ziegler提供。左：使用傳(chuan) 統的GaAsP探測器。右：使用STELLARIS 8。

了解了借助免疫熒光方法觀察細胞的原理，接下來獲得目標樣本並根據實驗設計合理製備用於(yu) 熒光觀察的樣片。