集光：顯微鏡中數值孔徑的重要性

在試圖區分顯微鏡下觀察到的樣本細節時，數值孔徑（縮寫(xie) 為(wei) ‘NA’）是一個(ge) 重要考慮因素。NA是一個(ge) 沒有單位的數，與(yu) 透鏡收集的光角度有關(guan) 。在計算NA（見下文）時還考慮了介質的折射率，通過將載玻片或細胞培養(yang) 容器的折射率與(yu) 浸沒介質相匹配就可以分辨出樣本的更多細節。光從(cong) 一種介質傳(chuan) 播到另一種介質時的行為(wei) 方式也與(yu) NA有關(guan) （稱為(wei) “折射"）。本文還介紹了折射的簡要曆史，以及這一概念如何成為(wei) 實現高NA的限製因素。

顯微鏡物鏡

如果您細看顯微鏡上的物鏡，您會(hui) 看到鏡筒處銘刻有多種不同的信息和數字。除了放大倍數和光學校正外，您還將看到另一組沒有單位的數字。這就是物鏡上的數值孔徑（或‘NA’）（見圖1）。

物鏡的NA是相對重要並且與(yu) 圖像分辨率相關(guan) 。簡單來說，分辨率是指物鏡區分樣本細節的能力。沒有對應的高NA，高放大倍數的物鏡也無法對樣本的細節加以分辨。

簡單來說，顯微鏡物鏡的NA就是透鏡在與(yu) 所觀察物體(ti) 的固定距離內(nei) 收集光的能力。光穿過樣本時，會(hui) 以倒錐形進入物鏡。但樣本中的部分光會(hui) 出現折射（和反射），這樣反過來形成的圖像會(hui) 具有較高的分辨率，並且比具有較低NA的物鏡包含更多的細節信息。

孔徑角

圖1：NA位於(yu) 放大倍數後麵（這裏是：40x/0.6）

孔徑角

物鏡前透鏡收集到的光錐角的最大徑向角度又稱為(wei) ‘孔徑角’（見圖1）。除了增加NA外，圖像亮度也與(yu) 孔徑角成正比。孔徑角隨物鏡焦距而變化，它與(yu) 物鏡前透鏡在樣本聚焦時捕獲的從(cong) 樣本發出的成像光線的最大角度有關(guan) 。

孔徑角與(yu) 物鏡焦距成反比。隨著焦距的減小，物鏡前透鏡所能收集的光量也會(hui) 增加。換言之，如果物鏡距離樣本很近，那麽(me) 物鏡可以收集到更多的斜射光線。應該說，孔徑角通常由物鏡內(nei) 的光學元件決(jue) 定，每個(ge) 物鏡都有一個(ge) 最佳焦距。打個(ge) 比方，想象一下：如果您站在一扇門前，門上有一個(ge) 鑰匙孔可以看到另一個(ge) 房間，那麽(me) 當您在遠處時隻能看到房間裏的一點點光和極少的物品。如果您把眼睛湊近鑰匙孔，您將會(hui) 看到房間裏更多的細節和光線，因為(wei) 理論上您增加了眼睛的孔徑角。

通過物鏡來收集並形成的圖像亮度和圖像細節（分辨率）與(yu) 孔徑角有關(guan) 。來自樣本的光會(hui) 連續通過蓋玻片與(yu) 物鏡前透鏡之間的空氣或者穿過浸沒介質。

圖2：孔徑角（A）是由前透鏡收集的

光錐的最大縱向角。α是光錐角的一半

NA的計算

數值孔徑可以用下列公式來表達和確定：
在以上公式中，‘n’為(wei) 蓋玻片和物鏡前透鏡之間的介質折射率（例如空氣、水或油）。‘α’符號與(yu) 光錐角的半角有關(guan) 並且可通過透鏡進行收集（即孔徑角；見圖2）。

圖3：物鏡的焦距越短則孔徑角越寬，

從(cong) 而獲得更高的NA和分辨率

空氣的折射率約為(wei) 1.0，而水的折射率為(wei) 1.3，用於(yu) 光學顯微鏡的一些浸油的折射率可以高達1.52。

折射

要*理解NA，先理解折射會(hui) 比較有幫助。在光學和顯微鏡學當中，折射是指光波穿過樣本以及從(cong) 樣本中傳(chuan) 來時改變了方向，這是由於(yu) 光傳(chuan) 播經過的介質（例如空氣、玻璃、水或油）發生了改變。‘斯涅耳定律’中的公式就很好地對折射進行了描述。Willebrord Snellius（1580-1626）是荷蘭(lan) 數學家和天文學家。他確定出計算地球半徑的新方法，還通過數學方法對折射進行了描述並因此名聲大噪。但他並不是第一個(ge) 用數學方式描述折射現象的人，更準確地說，他隻是“重新發現"了波斯數學物理學家Ibn Sahl 對於(yu) 這種現象的描述。Ibn Sahl在984年的手稿中，就闡述了曲麵透鏡和鏡子如何彎曲並聚焦光線。

斯涅耳定律中指出，入射光和折射光的角度之比等於(yu) 光通過的折射率之比的倒數。

簡單地說，當光線從(cong) 一種介質傳(chuan) 播到另一種介質時，它的速度會(hui) 發生改變 – 例如當光從(cong) 空氣傳(chuan) 播到水中時，光的速度會(hui) 減慢。此外，當光以非90°的角度進入介質時，其速度的變化會(hui) 導致方向改變。需要注意的是，光的頻率不會(hui) 改變，但是波長將由介質的性質決(jue) 定。

理論上，物鏡前透鏡收集的光錐的最大孔徑角為(wei) 180°，α值為(wei) 90°。由於(yu) 90度的正弦值為(wei) 1，因此能夠在空氣介質中從(cong) 樣本上收集180°合成光的物鏡的理論NA值也為(wei) 1。顯然，折射率是實現物鏡最高NA的限製因素。因此，高NA物鏡都會(hui) 用浸泡介質代替空氣，如油或水。現實中，在樣本和物鏡前透鏡之間有空氣的情況下NA值不可能達到1，因此“幹透鏡"（即非浸沒物鏡）的最高NA值接近0.95。這是因為(wei) 大多數透鏡無法從(cong) 樣本中收集180°的光，而最寬的角度約為(wei) 144°。144°的正弦值為(wei) 0.95而空氣的折射率為(wei) 1.0，因此理論上最大值NA接近0.95。

高倍放大物鏡搭配較低的NA最終隻能獲得較低的分辨率。很多顯微鏡企業(ye) 在其物鏡當中盡可能將NA提高。所以如果您正在考慮為(wei) 顯微鏡購買(mai) 新的透鏡，那就要隨時考慮如何在自己的預算範圍內(nei) 購買(mai) 到NA最高的物鏡了。