熒光壽命成像與熒光共振能量轉移的特點

體(ti) 內(nei) 生化定量
熒光壽命是熒光團在發射熒光光子返回基態之前保持其激發態的平均時間長度。這取決(jue) 於(yu) 熒光團的分子組成和納米環境。
FLIM將壽命測量與(yu) 成像相結合：對每個(ge) 圖像像素以測得的熒光壽命進行顏色編碼，產(chan) 生額外的圖像反差。因此，FLIM可以提供關(guan) 於(yu) 熒光分子空間分布的信息和有關(guan) 其生化狀態或納米環境的信息。 FLIM的典型應用是FLIM-FRET。FRET是研究分子相互作用的成熟技術。它能用來研究蛋白質結合並在埃的尺度上估算分子間的距離。
 

 
FRET—原理
熒光共振能量轉移(FRET)描述了存儲(chu) 在激發的熒光分子（供體(ti) ）中的能量向其附近的非激發的熒光分子（受體(ti) ）的非輻射轉移。FRET的發生必須滿足三個(ge) 條件：
供體(ti) 發射光譜與(yu) 受體(ti) 激發光譜的重疊（圖1）
在納米(10–9 m)級上分子必須非常接近（圖2–4）
分子必須具有適當的相對方位
 
圖1：供體(ti) 的發射光譜（此處為(wei) ECFP，藍線）必須與(yu) 受體(ti) 的激發光譜（此處為(wei) EYFP，黃線）重疊。這一要求意味著FRET對中的兩(liang) 個(ge) 分子都具有兼容的能級。

圖3：在遠大於(yu) 閾值R0（也稱為(wei) 福斯特半徑）的距離r處，無能量轉移。

 
圖4：如果分子緊密接觸，則來自激發光子（藍色箭頭）的能量以非輻射方式轉移到受體(ti) 。後者又發射光子（黃色箭頭）。該過程(E)的效率與(yu) r–6密切相關(guan) 。
 
影響
由於(yu) 與(yu) r-6密切相關(guan) （圖4），FRET發生在與(yu) 生化反應高度相關(guan) 的空間尺度上，例如蛋白質-蛋白質或蛋白質-DNA相互作用。FRET可以通過靈敏的熒光讀數來探測分子間的相互作用。這能讓研究人員在體(ti) 外和體(ti) 內(nei) 研究分子相互作用。通過合適的熒光標記將兩(liang) 個(ge) 相關(guan) 的相互作用方連接起來，可以分析雙分子相互作用。FRET還允許構建生物探針，通過強烈的構象變化導致的分子內(nei) FRET來報告第二信使的濃度或離子強度。
FRET無疑已發展成為(wei) 細胞生物學、生物物理學和生物醫學成像中廣泛使用的工具。
 
方法理論
有很多技術可以在顯微鏡環境中檢測FRET。常見的的是基於(yu) 供體(ti) （受體(ti) 光漂白，FRET AB）或受體(ti) （敏化發射，FRET SE）熒光強度的技術。
使用標準共聚焦顯微鏡可以輕鬆應用基於(yu) 強度的FRET。但它也存在缺點。FRET AB不能應用於(yu) 時間序列實驗，並且容易受到供體(ti) 分子的可逆光漂白或光轉換的影響。另一方麵，FRET SE受到所有FRET對固有光譜串擾的影響，需要仔細的校準測量以及對所得圖像的線性拆分。本文介紹了一種基於(yu) 熒光壽命顯微成像 (FLIM) 的FRET測量方法。
 
熒光壽命
熒光過程通常被理解為(wei) 分子中從(cong) 電子基態（S0）到其激發態（S1）的能量躍遷。（圖5，左）。這種躍遷可由具有適當能量（即頻率或波長）的入射光引起。吸收的能量由熒光分子儲(chu) 存一小段時間，然後才能作為(wei) 熒光發射。分子處於(yu) 激發態的時間稱為(wei) 熒光壽命。對於(yu) 許多有機染料和熒光蛋白，熒光壽命通常為(wei) 幾納秒(10–9 s)左右。
 
熒光壽命和FRET
從(cong) 激發態弛豫的另一種過程是FRET。通過FRET激發，能量以非輻射方式轉移到受體(ti) 分子。然後受體(ti) 分子以熒光方式弛豫（圖5，右）。由於(yu) 供體(ti) 發熒光和能量轉移是一個(ge) 相互競爭(zheng) 的過程，因此在存在FRET的情況下，激發態的消耗速率會(hui) 增加。有人可能會(hui) 說，供體(ti) 分子處於(yu) 激發態的時間越長，發生FRET的可能性就越大。隻能觀察到來自供體(ti) 分子且通過熒光弛豫的光子。轉移到受體(ti) 分子的能量由於(yu) 受體(ti) 熒光的波長較長而不會(hui) 被檢測到。 因此，FRET縮短了供體(ti) 熒光壽命（圖6）。

 
圖5：FRET對中的能量躍遷。與(yu) 供體(ti) 分子中的躍遷能匹配的光被吸收（藍色箭頭）。激發的供體(ti) 可以通過熒光（灰色箭頭，左）或通過共振能量轉移到受體(ti) 分子（黑色箭頭）而弛豫。

 
圖6：對激發後一段時間內(nei) 檢測到的熒光光子數作圖。激發脈衝(chong) 後發射光子的初始數量a0呈指數衰減。熒光衰減到a0/e (~ 37%)所需的時間為(wei) 熒光壽命。由於(yu) 存在FRET (τ-quench)，壽命τ變為(wei) 更短的時間。壽命衰減的另一個(ge) 讀數是振幅a0。測量掃描係統中每個(ge) 位置的壽命會(hui) 產(chan) 生壽命的空間圖（見插圖）。
 
熒光壽命成像 (FLIM)
Leica SP8 FALCON使用脈衝(chong) 激光和單光子計數檢測器在時域中測量熒光壽命。通過建立檢測到的熒光事件的直方圖來確定壽命。可顯示單指數或多指數熒光衰減。數值曲線擬合表示熒光壽命和振幅（即檢測到的光子數）。
由於(yu) FRET減少了供體(ti) 壽命，因此如果無FRET的供體(ti) 壽命已知，就可以量化FRET發生的程度。該供體(ti) 壽命τ作為(wei) 分析FRET樣品的絕對參考。因此，FLIM-FRET為(wei) 內(nei) 部參照—這一特點減少了基於(yu) 強度測量FRET時的很多缺點。由於(yu) 其熒光壽命是染料的固有特性，因此對其他不利影響（如光漂白、圖像明暗處理、不同濃度或表達水平）具有廣泛的不變性。
使用基於(yu) 強度的FRET測量的主要限製是所有可觀察的供體(ti) 分子都經曆FRET的基本假設。通常情況並非如此。供體(ti) 分子這種變化的“非結合"組分給測量的FRET效率帶來了相當大的不確定性，使得無法在實驗之間進行比較。FLIM-FRET克服了這一缺點。
 
使用活細胞記錄FLIM圖像
如前所述，FRET效率根據發生FRET供體(ti) 的壽命τquench與(yu) 未發生FRET的壽命τ的比率計算得出：

 
為(wei) 此，τ必須從(cong) 僅(jin) 包含供體(ti) 的樣品進行的測量來獲得。必須排除來自受體(ti) 的任何發射光。外部檢測器通常使用帶通濾色片。而內(nei) 部探測器可調節檢測範圍為(wei) 隻記錄供體(ti) 發射光。測量僅(jin) 供體(ti) 樣品和FRET樣品時必須使用相同的設置。
 
活細胞中的CFP-YFP FRET
在該工作中，我們(men) 使用由CFP-YFP融合蛋白組成的FRET構建體(ti) 瞬時轉染的培養(yang) RBKB78細胞（圖7）。兩(liang) 個(ge) 熒光蛋白由兩(liang) 個(ge) 氨基酸的短連接物連接[1]。這種供體(ti) -受體(ti) 融合也可以作為(wei) 真實場景中FRET的良好陽性對照。“僅(jin) 供體(ti) "樣品由僅(jin) 用CFP轉染的相同細胞組成（圖7A）。僅(jin) 供體(ti) 和FRET樣品（圖7B）的平均壽命可在快速FLIM模式下計算出近似值。壽命分布直方圖表明供體(ti) 的平均壽命τ為(wei) 2.1 ns（圖8）。FRET結構的供體(ti) 壽命為(wei) 1.4 ns。於(yu) 是測得FRET效率E = 1 – (1.4/2.1) = 33%。

 
頂行：圖7：僅(jin) 用CFP供體(ti) （A）和CFP-YFP融合（B）轉染的RBKB78細胞。使用光譜型FLIM檢測器將檢測範圍設置在445-495 nm之間。對彩色區域進行分析，顏色代表強度調製的熒光壽命。由德國維爾茨堡大學Gregory Harms教授提供。感謝Benedikt Krämer博士（Picoquant，柏林）、Jan-Hendrik Spille和Wiebke Buck對本實驗的支持。
底行：圖8：按平均壽命統計樣品中僅(jin) 供體(ti) （黃色）和發生FRET（綠色）的信號的熒光壽命分布。在FRET樣品中，壽命明顯變短0.7 ns。
 
FRET與(yu) 無FRET的比率
大家都知道的，CFP本身至少有兩(liang) 個(ge) 壽命組分[2，3]。此外，我們(men) 不知道研究中的所有分子是否都經曆FRET。為(wei) 了公正處理這種複雜性，人們(men) 需要了解平均壽命以外的信息。我們(men) 可以進行雙組分擬合，以此得到兩(liang) 個(ge) 壽命和兩(liang) 個(ge) 振幅。後者能使我們(men) 估算一個(ge) 壽命與(yu) 另一個(ge) 壽命的相對比例。尤其是使用振幅可以估算表現出FRET的組分（結合組分）和不表現出FRET的組分（遊離組分）的相對比例。含有較少第二個(ge) 組分的熒光蛋白，例如EGFP或Sapphire，是此類分析的理想選擇。