無標記熒光壽命成像的特點

生理學條件下的顯微鏡成像
很多生物樣品都會(hui) 產(chan) 生自發熒光。它的光譜往往很寬，會(hui) 幹擾熒光標記。本應用指南論述了自發熒光如何作為(wei) 熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)中的內(nei) 在對比度，從(cong) 而產(chan) 生多色圖像。此外還概述了如何將光譜成像與(yu) 熒光壽命信息相結合，以區分進而識別生物樣品中的不同熒光組分。

 
顯微鏡遇見自發熒光
在熒光顯微鏡觀察中，自發熒光通常被視為(wei) 很多生物樣品固有的瑕疵。它往往與(yu) 內(nei) 源性熒光信號的光譜相重疊，且有時會(hui) 掩蓋其信號。它可能會(hui) 導致光譜拆分和熒光強度比率分析定量的困難。自發熒光通常具有極寬的發射光譜，這使它在普通的光譜成像中拆分起來非常困難。
但自發熒光本身也有其優(you) 點。它是一種內(nei) 在的熒光信號，*自然無需標記。本應用指南旨在通過熒光壽命成像(FLIM)識別幾種自發熒光成分，並闡述它們(men) 在生物醫學研究中的應用
注：有關(guan) FLIM技術的基本原理，請參閱應用指南《FRET with Flim - Quantitative in-vivo Biochemistry》
 
自發熒光遇見生命科學
大多數生物樣品含有可引起自發熒光的生化成分。例如，細胞的氧化還原狀態反映在其NAD(P)H和flavins的濃度上。前者更適合用IR光源激發，後者也可以用405 nm激發。很多結構蛋白（例如膠原蛋白、彈性蛋白和纖原蛋白）都可以得到其熒光壽命圖像。
植物細胞尤其富含大量自發熒光分子。極為(wei) 常見的有葉綠素、類胡蘿卜素、多酚等。通常情況下，這些化合物不僅(jin) 可以提供無標記自發熒光，還可以提供有關(guan) 細胞或組織中代謝狀態或病理狀態的信息。因此，可以通過FLIM和自發熒光結合得出有關(guan) 細胞功能的結論。
 
無標記反差
為(wei) 了說明自發熒光在生物樣品中的作用，我們(men) 將分別考察動物界和植物界的示例。
我們(men) 先來看介殼蟲。收集並立即製作這種寄生蟲不同發育階段的標本。使用10倍物鏡記錄激發波長為(wei) 470 nm處自發熒光的概覽圖像（圖1）。熒光強度圖像FLIM數據創建，充分呈現了樣品的結構。此處的強度是每個(ge) 像素的光子計數，而非標準強度圖像。熒光強度無法區分任何自發熒光種類（圖1A）。這些信息包含熒光壽命圖（圖1B），呈現空間熒光壽命分布，它提供了不同熒光壽命成分的圖像。
就自發熒光而言，這通常代表不同的分子種類或其組合。我們(men) 可以很好地區分觸角和腿周圍殼多糖化的外骨骼（綠色到藍色）。殼多糖的壽命很短。周圍組織的熒光壽命比較均一接近3 ns（黃色）。某些具有較長壽命（橙色）的區域可能代表其他物質，但在此處，它們(men) 更可能代表較暗的區域，這些區域在熒光壽命的測量精度較低。
通常作為(wei) FLIM圖像感知和傳(chuan) 達的內(nei) 容實際上是強度調製熒光壽命圖（圖1C）。熒光壽命信息乘以強度圖像。這種再現方式傾(qing) 向於(yu) 不強調光子較少統計較差的較暗區域，並且保留了強度圖像中包含的更多結構信息。後者通常有助於(yu) 解釋熒光壽命，例如熒光壽命圖中的橙色區域。我們(men) 可以得出結論，FLIM能讓我們(men) 在不受幹擾的情況下識別不同的分子種類並研究其空間相互關(guan) 係。

 
圖1：介殼蟲的自發熒光圖像（腹麵觀）。強度圖像(A)、熒光壽命圖(B，去背景) 和強度調製熒光壽命圖像(C)。熒光壽命圖顯示至少三個(ge) 不同顏色編碼不同熒光壽命，並顯示空間位置信息。長度為(wei) 1.5 mm，截麵厚度為(wei) 1.3 μm。掃描格式280 x 512，物鏡10x NA 0.4，用470 nm激發，檢測478 nm至703 nm的發射（樣品由荷蘭(lan) 阿姆斯特丹NCI的Kees Jalink提供）。
深度–三維熒光壽命成像
仔細觀察自發熒光圖像（圖1），我們(men) 會(hui) 發現觸角外部有藍色區域，內(nei) 部有綠色區域。那麽(me) ，綠色區域是代表不同的成分，還是殼多糖熒光（藍色編碼）和周圍組織（黃色編碼）的混合？為(wei) 了解決(jue) 這個(ge) 問題，我們(men) 可以在較小的區域上使用較高NA的物鏡。我們(men) 還必須考慮圖像的z擴展。為(wei) 了更好地觀察結構的內(nei) 部，我們(men) 可以記錄FLIM z-stack（圖2）。事實證明，較短的壽命是由殼多糖引起，因為(wei) 觸角內(nei) 部的熒光壽命與(yu) 中間切麵顯示的周圍組織熒光壽命相同（圖2A，白框）。可以使用z-stack最大投影查看厚的結構（圖2B）。等值麵渲染促進了對3D切麵結構的更充分了解（圖3）。請注意，關(guan) 節不含殼多糖，這在FLIM數據中清晰可見。FLIM圖像能看到重要的分類特征，例如散布在所有身體(ti) 部位的毛狀剛毛，它們(men) 顯然含有殼多糖成分。

 
圖2：介殼蟲觸角的FLIM z-stack。使用40x NA 1.25鏡頭(A)記錄了約1 μm深度的40個(ge) 切麵。最大投影顯示了觸角和一些殼多糖化的毛發(B)。最大投影使用第三方軟件完成。視場為(wei) 388 x 151 μm。
 

圖3：使用圖2中顯示的層切圖像形成觸角的3D圖像。殼多糖化結構出現在帶有陰影的等值麵渲染中（綠色）與(yu) 周圍組織的3D圖像重疊顯示。（3D可視化使用外部軟件完成）。
多色自發熒光
植物中的熒光成像通常會(hui) 受到多種熒光物質的影響，例如葉綠素和多種細胞壁成分以及多種內(nei) 源性色素。在這裏，我們(men) 利用這些內(nei) 在的自發熒光團來顯示難以區分的結構。我們(men) 記錄了從(cong) 百合花中提取的花粉粒（小孢子）的z-stack熒光壽命圖像（圖4）。花粉粒的花藥具有肉眼可見和透射光（未顯示）可見的橙黃色。植物界中此類黃色熒光物質的可能的物質是類胡蘿卜素。我們(men) 獲得了0.5 ns到1.2 ns的熒光壽命。兩(liang) 個(ge) 主要物質的熒光壽命形成鮮明對比。綠色的是（假定的）管單元的網狀外層，它圍繞著呈現為(wei) 藍色(0.5 ns)的核心。Z切片顯示該核心未填充壽命較短的物質，而是在管細胞周圍形成薄的內(nei) 層（圖4A）。最大投影圖（圖4B）和3D可視化圖（圖4C）有助於(yu) 清晰顯示兩(liang) 個(ge) 層的相對立體(ti) 結構。

 
圖4：百合（百合花）的小孢子（花粉粒）。使用470 nm激發的自發熒光揭示了管細胞外層中兩(liang) 種結構不同的熒光物質。使用20x NA 0.7鏡頭檢測從(cong) 482 nm到744 nm(A)的發射熒光，記錄了45個(ge) Z軸層麵（A）。使用外部軟件(B)進行最大投影，並使用外部軟件(C)進行3D等值麵渲染。孢子的縱向延伸為(wei) 130 μm。