顯微光譜成像的特點

 
 
分色方法
多通道熒光成像的目的是將各種熒光染料發射的光子收集到獨立的檢測通道中。為(wei) 此，有必要對全發射光譜的組分進行空間分離，即將這些組分定位到不同的方向。傳(chuan) 統上，這種分離是通過“次級二向色鏡"（將照明與(yu) 發射分離的主要分光器，稱“主分光器"）進行的。出乎意料的是，還可以通過使用棱鏡或光柵來分離。根據光子的顏色對光子進行物理分類，這是一種原始的真彩分色方法。如果主要分色不充分，則可以通過數學分解來補充。

次級二向色鏡
自1970年以來，多通道熒光顯微技術在生物顯微技術領域的需求日益增加。在簡單的情況下，用於(yu) 單通道設置的濾光片和二向色鏡在本質上允許記錄例如，藍色或紫外線激發下的綠色和黃色/橙色熒光（當時被遺忘的標準是富爾根染色，它可以通過不同的發射顏色來辨別和）。寬場顯微技術通過使用彩色攝像機來達到這一要求。有時，特別是對於(yu) 定量測量，圖像被分割，兩(liang) 個(ge) 通道在同一芯片上並行成像。先進的是同時並行使用兩(liang) 個(ge) 或多個(ge) 攝像機。在真共聚焦掃描顯微技術中，不可能分割感應目標。因此，通過添加第二個(ge) （第三個(ge) ……）光電倍增管，立即實現了多通道熒光成像。並行記錄數據，數據可以直接顯示在屏幕上，例如，在監視器的3個(ge) 顏色通道中，或以電子方式存儲(chu) 以供以後分析。要顯示3個(ge) 以上的通道，信息必須分布在3個(ge) 可用的監視器通道中，這不可避免地會(hui) 導致分離度和強度分辨率的損失。然而，現代顯微技術不僅(jin) 僅(jin) 能得到清晰的圖像（無論如何，我們(men) 用肉眼隻能辨別三個(ge) 通道），還可以對其進行定量測量。在定量測量中，隻要通道數量不超過樣品中熒光染料物質的數量，任何數量的通道都是有意義(yi) 的。
 

 
圖1：帶有次級二向色鏡的4通道共聚焦掃描顯微鏡的布局圖（徠卡 ，1995年）。1和2設計為(wei) “濾光片輪"，而是固定反射鏡（適用於(yu) 3通道係統）或固定二向色鏡（適用於(yu) 4通道係統）。
 
將發射不同顏色的熒光染料發射到一組傳(chuan) 感器，最顯而易見的方法是使用二向色鏡。二向色鏡會(hui) 反射比二向色原定波長0更短波長的光，並能透射更長波長的所有顏色的光。這適用於(yu) “長通二向色鏡"。“短通二向色鏡"會(hui) 透射較短波長的光並反射光譜中較紅部分的光。在圖2中，一組三個(ge) 次級二向色鏡1、2和3用於(yu) 將全光譜分成4個(ge) 不同的方向，傳(chuan) 感器隨後可以在其中收集4個(ge) 不同的通道。必須根據所用熒光染料的光譜發射特性來選擇次級二向色鏡。因此，給定的一組次級二向色鏡可能適合許多發射方式類似的熒光染料，但如果熒光染料組合的發射特性顯著不同，則不適用。為(wei) 解決(jue) 這一問題，使用次級二向色鏡進行分色的係統在每個(ge) 分色位置都配備了片輪或滑塊。它們(men) 配備了一係列不同的二向色鏡，允許（有限）數量的不同色帶傳(chuan) 遞給傳(chuan) 感器。顯然，這種解決(jue) 方案不是很靈活，需要大量的伺服技術和調整（預計至少保持穩定數月。如果安裝許多激光線，則潛在發射帶的數量將會(hui) 增加——因此需要的次級二向色鏡的數量也會(hui) 增加。如果使用白激光，發射濾光片概念將無法合理適應，隻能使用連續可調的設備。圖1表明了1995年次級二向色概念的實現。
 

 
圖2：二向色鏡的色散。主分光器將激發與(yu) 發射分離。隨後通過次級二向色鏡1、2和3將發射分成四個(ge) 方向（本例）。常規二向色鏡反射短波長的光並透射“更紅"顏色的光，盡管相反的特性也同樣可能。
 
 
棱鏡的色散

 
圖3：基於(yu) 棱鏡的共聚焦檢測模塊示意圖，該模塊具有可單獨調節波段的5個(ge) 通道，用於(yu) 發射收集。
1）棱鏡，2）滑塊，3）檢測器
 
 
 
艾薩克·牛頓爵士在其1704年出版的《光學》一書(shu) 中描述了最古老的（有目的的）光分色方法：使用棱鏡。本文的序言部分附有牛頓那本書(shu) 的插圖。我們(men) 如今的解釋是，在不同光學介質的邊界處，較短波長的光將比較長波長的光的衍射更強（作出一個(ge) 簡單的結論）。如果將不同顏色混合後（如一組熒光染料組合發射），穿過棱鏡，則組合發射將在光譜上分解。
 
分解強度取決(jue) 於(yu) 多個(ge) 技術參數，但與(yu) 樣品或傳(chuan) 感器無關(guan) 。這是一個(ge) 非常有效和直接的解決(jue) 方案，可以讓一組熒光染料發射指向不同方向，這樣就可以記錄下來。在簡單的情況下，隻需沿著光譜放置一係列檢測器。這一概念已經實現了，但在收集效率和靈活性方麵還存在嚴(yan) 重缺陷。多波段設備是更好的解決(jue) 方案，對每個(ge) 要記錄的傳(chuan) 感器，其允許單獨選擇全光譜的任何部分。
 
棱鏡具有全光譜（平麵）透射的優(you) 勢，即棱鏡（在原定的光譜範圍內(nei) ）沒有吸收調製。透射和色散與(yu) 偏振方向無關(guan) 。這是一個(ge) 重要的定律，因為(wei) 熒光染料的發射總是非偏振的。最後但並非最不重要的是，色散僅(jin) 發生在一個(ge) 方向上——在選擇的階數中，沒有其他“階數"可以降低色散的強度。
 
本文對色散光譜的線性問題進行了討論。基於(yu) 棱鏡的光譜與(yu) 波長不呈線性關(guan) 係。這對於(yu) 技術設計而言不是問題，隻要不使用線性檢測器組合，例如多陽極光電倍增管或類似設備。

 
圖4：棱鏡的色散。由於(yu) 玻璃棱鏡的折射能力取決(jue) 於(yu) 衍射光的波長，因此不同波長的組合將被分散。在白光的情況下，色散圖案是一個(ge) 連續的光譜。多重標記熒光樣品的發射將產(chan) 生一個(ge) 在熒光染料發射最大值處具有最大值的光譜。這一技術是通過單個(ge) 傳(chuan) 感器收集盡可能多的單一染料。
 
 
光柵色散

 
圖5：光柵與(yu) 棱鏡的效率比較。光柵（藍色曲線）針對“閃耀"波長進行了優(you) 化，該波長兩(liang) 側(ce) 的效率都會(hui) 下降。而且，特定的偏振方向的透過效率很好（在閃耀時）。在短波段內(nei) ，垂直偏振顯著下降。棱鏡的效率主要取決(jue) 於(yu) 所使用的玻璃類型，並且在長程範圍內(nei) 是平麵且非偏振的（此處：用於(yu) 可見光發射的冕玻璃）。
 
 
棱鏡的另一個(ge) 色散元件是光柵。透射光柵和反射光柵都在使用。用入射光束照明時，光柵的周期性結構將使光偏轉到不同方向（通過幹涉過程）。
 
直線方向（0階）不顯示任何色散。通常選擇的方向是一階。在這裏，光分散為(wei) 光譜，非常類似於(yu) 棱鏡中的色散。然而，還有更多的階數，如2階和更高階，但在光柵法線的另一側(ce) ，也有反射1階……階。光柵製作技術是將盡可能多的能量集中在一個(ge) 單一的階數中。
 
對於(yu) 平行或垂直於(yu) 線（凹槽）方向的偏振光，光柵的表現也迥然不同。雖然垂直波在*佳情況（取決(jue) 於(yu) 各種參數）下可以產(chan) 生相當有效的光譜，但平行波在距離閃耀波長兩(liang) 個(ge) 八度範圍內(nei) 顯著下降——大約降為(wei) 零。由於(yu) 熒光是非偏振的，因此用垂直效率和平行效率的平均值來描述總效率。在可見光200 範圍內(nei) ，下降到30%是常見的。
 
對於(yu) 效率（光子收集性能）是關(guan) 鍵問題的儀(yi) 器而言，這使得光柵成為(wei) 非常低效且不合適的色散器件——在共聚焦熒光顯微技術中也是如此。如果該技術實現，通常會(hui) 附加一係列額外的設計元件，試圖引導丟(diu) 失的光子進入傳(chuan) 感器（有時稱為(wei) “光子回收器"）。
 
更複雜的是，與(yu) 棱鏡相比，光柵的雜散光損失要大得多。

 
圖6：光柵產(chan) 生包含入射光束光譜的若幹階數。通過所用的階數與(yu) 入射光束的比值來計算絕對效率。
 
 
色散器的比較
如上文所述，在共聚焦顯微技術中，熒光發射色散的各種概念各有優(you) 缺點。比較概述如下表所示。顯然，棱鏡是完成這項任務的不錯之選。