如何實現快速、穩定的多色活細胞成像

MICA如何幫助用戶研究活細胞和動物

研究人員在活細胞成像技術的幫助下，可以深入了解活細胞甚至完整生物體(ti) 的動態過程，這包括細胞內(nei) 和細胞外活動。一些代表性的示例包括蛋白質或脂質轉運、免疫細胞遷移，類器官的細胞組織等。活細胞成像要求樣本和顯微鏡係統具備特定的屬性。在這篇文章中，我們(men) 描述了MICA對這些先決(jue) 條件的具體(ti) 調整，並提供了合適的示例。

活細胞成像

活細胞成像在微觀層麵揭示了生物過程的信息。它要求將標本保存在接近生理的條件下。下一段介紹了部分條件。典型的樣本包括細胞培養(yang) 物、活組織、類器官或模式生物，通常使用熒光顯微鏡研究這類樣本。為(wei) 此需要轉染細胞，從(cong) 而產(chan) 生表達熒光標記蛋白質的轉基因體(ti) 。此外，還可以使用活細胞染料。

挑戰

環境條件：

為(wei) 盡可能獲得接近真實狀態的實驗結果，活細胞成像條件必須模擬生理環境。不同的生物體(ti) 所需的生理條件也不同，包括溫度、pH、氧氣含量等。例如，哺乳動物細胞要求的溫度是37°C左右，昆蟲細胞的最佳溫度是27°C，魚為(wei) 28°C，而裂殖酵母則為(wei) 30°C左右。

在碳酸氫鈉緩衝(chong) 液的幫助下，細胞培養(yang) 基內(nei) 的pH值持續保持在7.0-7.4，這就要求培養(yang) 箱環境中相應地存在二氧化碳。此外，培養(yang) 箱的環境應該是水飽和的，這樣就不會(hui) 有培養(yang) 基蒸發了。

體(ti) 內(nei) 不同組織和細胞類型的氧含量不同。有趣的是，目前細胞培養(yang) 箱和活細胞成像並沒有廣泛考慮氧的問題。不理想的氧氣水平會(hui) 導致增殖率下降（高氧）或代謝率降低（低氧）（Hadanny, A.; Efrati, S.）。

光保護是活細胞成像的另一個(ge) 挑戰，因為(wei) 光照射可以影響活細胞本身以及熒光團。例如，強光可以導致DNA損傷(shang) 或光漂白熒光團。

MICA的設計旨在應對所有這些挑戰：

外殼本身就像一個(ge) 培養(yang) 箱。這意味著樣本周圍空間被加熱到所需的溫度（比室溫高5°C，最高42°C），並平衡到所需的二氧化碳濃度和濕度。

如果需要的話，氧氣濃度可以在一個(ge) 額外的載物台頂部腔室中控製。所有的參數均可通過MICA LAS X軟件控製。樣本的曝光由OneTouch功能設置，並可通過“樣本保護-圖像質量"滑塊進行調整，以平衡所需的信號量與(yu) 保護活細胞和熒光團。

為(wei) 了在最小的環境幹擾下獲取樣本，在前門中隱藏有一個(ge) 小的服務擋板。

圖1：MICA是一個(ge) 培養(yang) 箱。蓋子下麵的整個(ge) 空間被平衡到所需的溫度、濕度和二氧化碳濃度。為(wei) 了快速檢查樣本或操作，前蓋可以折疊下來，一個(ge) 小的服務擋板可以滑開。

光可能是有毒的

由於(yu) 光是帶入樣本的能量，它可能有負麵的影響。任何光都可能幹擾細胞內(nei) 的分子，例如紫外線可能傷(shang) 害皮膚。此外，熒光團可能形成與(yu) 分子相互作用的自由基。光的負麵作用被稱為(wei) 光毒性。挑戰在於(yu) 能產(chan) 生足夠的信號來解答科學問題的足夠光量與(yu) 盡量減少光毒性的平衡。MICA通過提供一個(ge) 工具來幫助用戶在不需要了解技術背景的情況下精確地平衡這兩(liang) 件事——保護-質量滑塊。隻需點擊一下，OneTouch將根據滑塊上的選擇設置所有的激發和檢測參數。

細胞內(nei) 的動態變化可能非常快。例如，攜帶細胞器或囊泡的分子速度可達幾微米/秒（Alberts B.等人）。這影響了對圖像采集的要求，特別是當需要對多個(ge) 熒光團進行成像時。這裏的問題是，生物不會(hui) 暫停所有的熒光通道從(cong) 而在相同的狀態下進行采集，而是持續不斷進行。在一個(ge) 經典的基於(yu) 熒光過濾器的係統中，通常最耗時的步驟是為(wei) 不同的通道更換濾光片。這導致實驗中兩(liang) 個(ge) 熒光團在兩(liang) 個(ge) 不同的時間點被監測，導致無法實現精確的時空相關(guan) 性。

MICA FluoSync™技術使用戶能夠同時獲得多達四個(ge) 熒光通道。這意味著不同的囊泡、細胞骨架和運動蛋白可以以100%的時空相關(guan) 性進行成像。此外，同步采集使成像時間點的節奏更快，因此，可以用更靈敏地記錄快速的細胞運動。

在給定的時間範圍內(nei) 記錄許多重複的情況

在一個(ge) 實驗中記錄許多次重複可能是一個(ge) 挑戰。假設用戶想每10分鍾記錄一次，那麽(me) 在下一個(ge) 周期開始之前，隻能記錄一定數量的位置。通常情況下，如果您想在同一位置記錄多個(ge) 標簽，就會(hui) 有更多限製，但MICA不存在這個(ge) 問題。FluoSync™技術使用戶能夠以四倍的速度記錄，因為(wei) 它最多可以同時獲取四個(ge) 標簽，從(cong) 而為(wei) 用戶留下更多的時間來記錄更多位置。用戶不必再在標簽數量和位置之間進行權衡。

尋找正確的位置進行成像

在樣本的正確位置上尋找和設置實驗是具有挑戰性的。實驗人員需要使用目鏡了解樣本的整體(ti) 概況，並記住不同的位置。數字顯微鏡可以生成樣本的預覽，這可以提供一些幫助，但實驗人員仍然需要指出圖像中要進一步成像的位置。MICA的Navigator工具可簡化這一過程。用戶可以生成低放大倍數或高放大倍數的預覽，輕鬆定位感興(xing) 趣的區域，這些感興(xing) 趣區域可以用工具直接在圖像上標記出。通過這種方式，後續高分辨率的圖像可以保存下來。

選擇正確的活細胞成像物鏡

由於(yu) 活細胞成像通常是在水溶液中進行的，高倍率物鏡使用水作為(wei) 浸沒介質，因為(wei) 它與(yu) 培養(yang) 基介質的光學特性相匹配。將水放在物鏡和樣品之間是很麻煩的，而且會(hui) 導致樣本的焦點和位置的改變。此外，水蒸發得相當快，因此需要不斷補充。MICA集反饋回路於(yu) 一體(ti) ，在水浸式物鏡的整個(ge) 使用過程中，首先建立並維持浸沒狀態。這種方法不需要手動操作，可以進行長期實驗。

為(wei) 進一步提高光學質量，一些物鏡會(hui) 通過校正環來補償(chang) 樣本平板的厚度。校正環可手動、也可自動操作。MICA配置了自動校正環功能，可實現自動優(you) 化。

重複實驗之間的可比性

科學實驗的一個(ge) 關(guan) 鍵方麵是，盡可能少的變更可變參數以實現對樣品和結果影響的把控。這包括在所有的實驗中應用同一套成像條件。一個(ge) 方麵是穩定的環境條件（溫度、pH值和O2，也見上文）。另一個(ge) 重要方麵是相同的成像參數（激發和檢測）。MICA默認在不同項目中保持成像參數不變，用戶僅(jin) 基於(yu) 自己的需求進行調整。可根據參考圖像恢複成像參數。在環境條件方麵，MICA是一個(ge) 培養(yang) 箱。MICA條件穩定能允許MDCK囊腫連續生長3周（也見下文）。

方法

Mica有用於(yu) 活細胞成像的特殊的樣本架。這包括用於(yu) 小型（36毫米）和中型（60毫米）培養(yang) 皿的支架。

圖2：活細胞成像樣本架。有適用於(yu) 不同尺寸的培養(yang) 皿的支架。活細胞成像也可以使用經典的載玻片支架（未顯示），例如，使用ibidi µ-Slide 8 Well載玻片支架。

囊泡:

U2OS細胞同時用WGA-Alexa488和WGA-Alexa555進行染色。這兩(liang) 種染料都聚集在細胞的質膜和所有囊泡和內(nei) 體(ti) 上。熒光劑同時或序列成像以進行比較。環境被設定為(wei) 37℃恒溫和5%CO2，即生理pH水平。

對於(yu) 高倍率成像，使用了帶有自動加水功能的63x/1.20水鏡。不需要人工操作。

斑馬魚:

圖像中的魚（斑馬魚）是一個(ge) 帶有中胚層命運報告基因的轉基因魚（Tbxta：GFP）。在這個(ge) 實驗中，一個(ge) 發育中的胚胎從(cong) 球期到體(ti) 期被成像。用Dextran-Alexa647標記間質。胚胎保持在28℃。

囊腫：

a)將穩定轉染了EB1-GFP的MDCK細胞在基質Matrigel中培養(yang) ，在ibidi µ-Slide 8 Well玻片上誘導囊腫生長。環境被設定為(wei) 保持恒定的37℃，5%的二氧化碳和高濕度。

在第2天，細胞已經顯示出三維聚團，並在基質Matrigel內(nei) 高度流動。

在第9天，囊腫保持相對穩定的位置，用較高的放大率（63倍）進行成像並在穩定狀態下和隨著時間的推移（6天和6小時的時間間隔的GFP和IMC（明場成像的調製對比））。三維采集能獲得囊腫的三維圖像（418層，220.7納米間距，總Z-Stack大小92.02微米）。在第9天，一些囊腫除了EB1-GFP之外，還被Mito-Blue、SiR-Actin和Tubulin-SPY555標記。

b)5000個(ge) 穩定地轉染了EB1-GFP的MDCK細胞在U型孔板中生長。有趣的是，這些細胞在幾天後也形成了囊狀結構。其中一個(ge) 囊狀結構在共聚焦模式下被進一步研究，以進行三維重建。

結果
短期的快速事件實驗

U2OS細胞用兩(liang) 種不同的熒光染料標記相同的結構，WGA-Alexa488和WGA-Alexa555，它們(men) 都與(yu) 細胞膜結合。通過在MICA序列模式下獲取兩(liang) 個(ge) 通道的這個(ge) 實驗設置能夠在獲取WGA-Alexa488（綠色）和WGA-Alexa555（紅色）之間引入一個(ge) 人為(wei) 的時間差。有了這種實驗設置，兩(liang) 種不同的Alexa染料標記同樣的膜結構，能夠在最小時間差的兩(liang) 個(ge) 時間點成像。你可以在兩(liang) 種方法的比較中看到，在同步掃描中所有的囊泡都是黃色的——即綠色和紅色的混合物，而在序列掃描中一些快速移動的囊泡看起來是兩(liang) 種不同的結構——即一個(ge) 綠色和一個(ge) 紅色的囊泡。

視頻 1：用WGA-Alexa488（綠色）、WGA-Alexa555（紅色）標記的U2OS細胞。熒光通道是按序列成像的。你可以看到時空錯配，這可以通過來自同一結構的綠色和紅色信號來識別。比例尺 = 5 µm。

視頻 2：用WGA-Alexa488（綠色）、WGA-Alexa555（紅色）標記的U2OS細胞。熒光通道是同時成像的。比例尺 = 5 µm。

中期實驗

斑馬魚是一種模式生物，經常用於(yu) 發育研究。在這個(ge) 例子中，我們(men) 感興(xing) 趣的是研究細胞在空間的協調性，而這種協調性受到周圍組織的粘度的影響。在THUNDER模式下對兩(liang) 個(ge) 通道進行了24小時的成像，並使用大容量成像解析（LVCC）以獲得更多的細節。

視頻 3：表達中胚層命運報告基因的發育中的斑馬魚胚胎（Tbxta:GFP；綠色）。間質液用Dextran-Alexa647（紅色）標記。在超過24小時的延時拍攝中，用10x/0.32物鏡采集了25個(ge) z-層和250微米厚度的z-堆棧，時間間隔為(wei) 15分鍾。使用了THUNDER 大容量成像解析（LVCC）。由Camilla Autorino提供，Petridou Group, EMBL Heidelberg（德國）。

長期實驗

MDCK細胞是極化的上皮細胞，如果在Matrigel這樣的基質上培養(yang) ，會(hui) 成熟為(wei) 所謂的囊腫。這些三維結構可用於(yu) 研究發育過程和潛在的蛋白質運輸機製。這裏，細胞被穩定地轉染了與(yu) GFP相連的微管結合蛋白，並在MICA中培養(yang) 了3周。

圖3：MDCK囊腫。3周的活細胞實驗的提取物。時間間隔為(wei) 6小時。擴展景深（EDOF）。上圖：通道疊加。中圖：EB1-GFP。下圖：寬場。THUNDER大容量成像解析（LVCC）。比例尺為(wei) 20μm。圖片由德國馬爾堡菲利普斯大學的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

發育9天後，用活細胞染料對上述一些囊腫進行了染色，以觀察肌動蛋白、微管蛋白和線粒體(ti) ，此外還有GFP標記的微管結合蛋白。隨後，在共聚焦模式下對囊腫進行了成像。

圖4：第9天的MDCK囊腫（CLSM）。除EB1-GFP(綠色)外，部分囊腫用Mitto - blue(品紅色)、SiR-Actin(紅色)和Tubulin-SPY555(黃色)染色，並用63x/1.20物鏡在共聚焦模式下成像。比例尺 = 20 µm。圖片由德國馬爾堡菲利普斯大學的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

在U型孔板中培養(yang) 細胞也可形成囊狀結構。本實驗中，MDCK細胞從(cong) 第1天開始在MICA上培養(yang) 並在明場和寬場熒光模式下記錄，以研究囊腫的形成。MICA培養(yang) 箱的特性使細胞在發展成囊狀結構的過程中保持良好的狀態。

視頻 4：用10x/0.32物鏡、在GFP和明場通道下每隔30分鍾對囊腫形成進行了三天的成像。比例尺 = 200 µm。

培養(yang) 14天後，在低倍鏡共聚焦模式對囊腫進行成像，以確定一個(ge) 感興(xing) 趣的囊腫。96孔板的情況下篩選樣本以尋找合適位置來做進一步研究可能是很麻煩的。Navigator工具在此幫助保持樣本的預覽，並輕鬆地導航到相關(guan) 的感興(xing) 趣的區域。

圖5：用10x/0.32物鏡和GFP通道對第14天的囊腫進行預覽（CLSM）。

然後用63x物鏡在LIGHTNING共聚焦模式下對其中一個(ge) 囊腫進行了更細節的成像。63x/1.20水鏡的加水是自動建立，並通過自動校正環對樣品進行了優(you) 化。視頻5顯示了在共聚焦模式下獲得的卷積和用LIGHTNING處理的卷積的對比。

視頻 5：用63x/1.20水鏡在共聚焦模式下（左）用LIGHTNING（右）拍攝的單個(ge) 第14天的囊腫（CLSM）。采集了285個(ge) Z-層， 57µm厚度的Z-層，並進行了三維重構。

結論

MICA高度適用於(yu) 快速、短期到幾周的長期活細胞成像實驗，幫助用戶獲得可靠的結果。集成的培養(yang) 係統在溫度和pH值方麵提供了接近生理的條件，使活細胞成像可以持續數周。另外，可以控製氧氣水平，以獲得更高的重要數據。FluoSync™技術可以同時對多達四個(ge) 熒光團進行成像，這意味著可以對快速發生的細胞事件進行絕對的時空相關(guan) 性成像。此外，FluoSync™縮短了記錄多色圖像之間的間隔，從(cong) 而提高了時間分辨率。THUNDER和LIGHTNING幫助用戶從(cong) 樣本中提取更多的細節，借助OneTouch的照明和自動浸水的自動化流程，即使是僅(jin) 接受少量培訓和有限技術背景的人員都可以輕鬆使用。

了解更多：徠卡顯微

參考資料

• Making Long-term Time-lapse Microscopy More Efficient, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

• Hadanny, A.; Efrati, S. The Hyperoxic-Hypoxic Paradox. Biomolecules 2020, 10, 958.

• Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Molecular Motors.