解鎖單細胞空間蛋白組學分析技能

前言

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在當今這個(ge) 科研節奏飛快的時代，想要把科學論點高調地發表在頂級期刊上往往需要運用多種技術采集“立體(ti) 而豐(feng) 滿"的結果作為(wei) 論據支持。以組織樣本為(wei) 例，要實現單細胞分析，我們(men) 很容易會(hui) 想到流式細胞術（Flow cytometry）。在此基礎上進行空間定位分析，免疫組化（Immunohistochemistry）的優(you) 勢則非常明顯。而說到蛋白組學分析，質譜分析法（Mass spectrometry）無疑是最“接地氣"的手段。喜愛高效率的我們(men) 不禁會(hui) 問：“有沒有一個(ge) 技術能綜合單細胞、空間定位和蛋白組學分析的優(you) 點呢？" 這時，徠卡人會(hui) 自豪地告訴你：“Cell DIVETM了解一下~" 接下來，讓我們(men) 結合實際應用，看看Cell DIVETM在單細胞、空間定位和蛋白組學分析方麵的優(you) 勢。
 

小鼠腸道簇狀細胞單細胞分析

通過成像手段實現單細胞分析的最大難點在於(yu) 如何實現單一樣本的多色標記。傳(chuan) 統熒光免疫組化技術受到熒光染料光學特征的限製，難以完成一個(ge) 樣本內(nei) 超過7種生物標誌分子的成像任務。Cell DIVETM技術通過多輪染色的手段克服了該難題，可以在一個(ge) 樣本內(nei) 實現多於(yu) 60種生物標誌物的成像檢測。配合病理分析軟件，可以輕鬆地完成每個(ge) 細胞內(nei) 各種生物標誌分子的半定量分析。

下麵這篇文章就是我們(men) 美國範德比爾特大學醫學中心（Vanderbilt University Medical Center）的客戶用Cell DIVETM完成的小鼠小腸簇狀細胞（Tuft cells）14種生物標誌物的成像和異質性分析[1]。簇狀細胞，也叫做多吞飲小管細胞 （Caveolated cells），是一種分布於(yu) 胃腸道的罕見細胞類型，約占所有腸上皮細胞的0.4%，其頂端呈現密集的微絲(si) 結構，並在化學傳(chuan) 感（Chemosensing）中發揮作用。

作者通過功能性蛋白檢測不僅(jin) 發現了小腸簇狀細胞的數量、組成和功能受飲食和腸道菌群調控的規律，還發現了Hopx和p-EGFR高表達的兩(liang) 個(ge) 新簇狀細胞亞(ya) 群，為(wei) 腸道簇狀細胞的進一步研究提供了基礎框架。在本研究中，Cell DIVETM發揮了強大的單細胞分析能力，幫助作者完成簇狀細胞的精確定位和功能性分子表達量分析（圖2）。

圖2 小鼠簇狀細胞（Tuft cells）超多標成像-分析圖 [1] 

（1A）細胞圈選分割示意圖，（2A & B）細胞群體(ti) t-SNE分析及簇狀細胞異質性分析，（3）簇狀細胞功能性分子熒光成像圖。

腫瘤-免疫細胞空間定位分析

分子空間定位信息的呈現是顯微成像技術的傳(chuan) 統優(you) 勢，但難以對成像數據進行深度信息挖掘，導致圖像往往隻能作為(wei) 文章結論的“助攻"型結果。作為(wei) 一套整體(ti) 解決(jue) 方案，Cell DIVETM結合了當今定量病理分析行業(ye) 的金標準——HALO軟件（圖3），使圖像深層信息的呈現不再遙不可及。單細胞生物標誌物定量、組織區域AI智能識別、細胞密度/浸潤/距離分析等HALO最擅長的分析方式能輕鬆解碼超多標圖像的隱藏信息。

圖3 HALO定量病理分析示意圖

接下來，我們(men) 通過一篇由美國梅奧診所（Mayo Clinic）的客戶發表的惡性黑色素瘤微環境研究的文章來看看Cell DIVETM強大的空間定位分析能力[2]。腫瘤微環境中腫瘤細胞和免疫細胞的相互作用關(guan) 係對研究腫瘤免疫應答具有重要意義(yi) 。

作者用Cell DIVETM技術對173例III期惡性黑色素瘤病人臨(lin) 床樣本中21種生物標誌分子進行成像（圖4），進而通過分析多個(ge) 免疫細胞亞(ya) 群的浸潤特征，找到決(jue) 定異質性腫瘤微環境中淋巴細胞浸潤的關(guan) 鍵因素——高表達HLA-1的腫瘤細胞。在本研究中，Cell DIVETM展現了優(you) 秀的批量數據處理和空間定位分析能力，幫助作者完成不同HLA表達水平的腫瘤細胞與(yu) 淋巴細胞的精準定位分析（圖4-6A）。

圖4 黑色素腫瘤微環境中免疫細胞空間定位分析圖 [2] 

（1B）腫瘤病人淋巴結分區視野選擇示意圖，熱圖顯示所選視野標記分子表達差異，（3A & B）腫瘤微環境中淋巴細胞浸潤密度分析，（6A）免疫細胞空間定位分析。

結腸癌MAPK信號通路蛋白組學分析

技術研發初期，Cell DIVETM之所以選擇多輪抗體(ti) 標記路線的原因之一是為(wei) 了突破單一樣品中檢測生物標誌分子的數量限製。作為(wei) 一種理論上沒有標記上限的實驗手段，多輪抗體(ti) 標記法可以更好地滿足後續蛋白組學分析在標誌分子數量上的需求。

為(wei) 了更高效地進行實驗設計，Cell DIVETM研發團隊在技術研發的同時，進行了抗體(ti) 庫的建立。目前，已經完成了350餘(yu) 種特異性抗體(ti) 的Cell DIVETM技術兼容性測試。不僅(jin) 如此，我們(men) 還根據多個(ge) 領域內(nei) 著名的生信數據庫（如KEGG PATHWAY等）將抗體(ti) 按照不同研究方向進行歸類。用戶可以在抗體(ti) 庫內(nei) 根據自己感興(xing) 趣的研究方向查找關(guan) 鍵蛋白，極大地提高了實驗設計環節中抗體(ti) 選擇的效率（圖5）。

圖5 腫瘤研究Cell DIVETM已驗證抗體(ti) 數（部分）

Cell DIVETM研發時期的一篇文章向我們(men) 展現了上述的抗體(ti) 資源庫在腫瘤病理分型方麵具有優(you) 勢[3]。為(wei) 了優(you) 化結直腸癌病理分型係統，作者利用抗體(ti) 資源中的一係列生物標誌物對747例I至III期結直腸癌樣本進行了Cell DIVETM單細胞空間蛋白組學分析。針對不同生理事件和關(guan) 注的信號通路，作者選取了細胞應激、細胞外基質、調節蛋白和激酶等61種生物標誌分子。

通過蛋白組學分析，作者發現mTORC1通路上遊蛋白RPS6、4E-BP1和ERK1/2的磷酸化程度有望作為(wei) 判斷結直腸癌病人雷帕黴素耐藥的關(guan) 鍵指標（圖6）。這裏不得不表揚一下Cell DIVETM抗體(ti) 測試團隊，完成了大量的抗體(ti) 驗證工作，幫助Cell DIVETM用戶在實驗設計環節節約了不少抗體(ti) 信息檢索的時間。

圖6 結直腸癌Cell DIVETM檢測和蛋白組學分析 [3] 

結語

作為(wei) 一套整體(ti) 解決(jue) 方案，Cell DIVETM涵蓋了從(cong) 實驗設計到圖像采集再到結果分析的全套標準化操作流程、優(you) 秀的成像設備和強大的數據解析係統，幫助用戶輕鬆實現超多標（>10種標記分子）成像，解鎖單細胞空間蛋白組學分析技能。

圖7 Cell DIVETM 超多標組織成像分析整體(ti) 解決(jue) 方案

參考文獻：

[1] Eliot McKinley, et al. Optimized multiplex immunofluorescence single-cell analysis reveals tuft cell heterogeneity. JCI Insight. 2017, 2(11): e93487

[2] Yan Yiyi, et al. Understanding heterogeneous tumor microenvironment in metastatic melanoma. PLoS ONE. 2019, 14(6): e0216485

[3] Gerdes MJ, et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. PNAS, 2013, 110(29): 11982–11987