徠卡顯微鏡的活細胞成像技術

了解複雜且快速變化的細胞動力學是深入探索生物進程的重要一步。因此，現代生命科學研究越來越需要關(guan) 注於(yu) 在分子水平上實時發生的生理事件。

 
 
觀察和分析活細胞時麵臨(lin) 的挑戰
在固定細胞或組織中，獲取樣品“分子狀態"的信息已是一項艱巨的任務。如果需要獲取實時信息，，就必須盡可能在實驗過程中保證細胞自然地運行生理機製，因此將加大實驗的困難程度。此外，由於(yu) 很多生理過程的持續時間僅(jin) 有幾秒甚至幾毫秒（例如細胞內(nei) 離子水平的變化），必須在相對較短的時間內(nei) 采集大量信息。
滿足這些挑戰性需求的一種方法是采用被統稱為(wei) 活細胞成像的光學技術。活細胞成像可研究活細胞中的實時動態生理過程，而非提供細胞當前狀態的一幅“快照"。它把快照轉變成了電影。活細胞成像可提供單個(ge) 細胞、細胞內(nei) 網絡（原位）甚至整個(ge) 生物體(ti) （體(ti) 內(nei) ）中動態發生分子事件的空間和時間信息。這些特性讓活細胞成像成為(wei) 了研究細胞生物學、癌症、發育生物學和神經科學中動態生理過程的必要技術。
近年來，電子學、光學和生物化學的迅速發展，使得科學家們(men) 更輕鬆的實現活細胞成像。如今的活細胞成像方法使用優(you) 化的顯微鏡、專(zhuan) 用光源、高速相機、高靈敏度探測器和特異性的熒光標記物，可同時提供技術成熟且仍具有創新性的全套解決(jue) 方案，滿足在分子水平上對單細胞或整個(ge) 細胞網絡進行實時研究的挑戰性需求。
使用線粒體(ti) 標記物(MitoRed®)和熒光鈣染料(Fluo-4)對細胞進行活細胞成像

 
圖1：熒光鈣染料Fluo-4標記的睾丸支持細胞的原代培養(yang) 。鈣染料的位置類似於(yu) 表征細胞內(nei) 的鈣分布。

 
圖2：線粒體(ti) 標記物MitoRed®染色的睾丸支持細胞的原代培養(yang) 。

 
圖3：圖1和圖2的疊加。觀察鈣斑和線粒體(ti) 的共定位情況。

 
圖4：睾丸支持細胞的DIC圖像。
 
使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像軟件獲取的圖像。由德國亞(ya) 琛工業(ye) 大學生物II研究所化學感知係Sophie Veitinger博士提供。（地址：德國馬爾堡菲利普斯大學細胞生物學和細胞病理學研究所）
對應刊物（非圖片來源）：
 
活細胞成像中的常見問題
活細胞成像通常適用於(yu) 培養(yang) 的細胞係（例如HEK細胞、HeLa細胞）、原代細胞（例如皮膚細胞、神經細胞）、急性製備的組織切片（例如腦切片）或整個(ge) 器官或生物體(ti) 。因為(wei) 細胞被帶出其原本“自然"的培養(yang) 環境並會(hui) 受到光毒性的影響，所以在實驗過程中的首要任務是保持細胞的健康狀態。
 
細胞外溶液
不同類型的人工細胞外溶液（林格氏液、人工腦脊液(ACSF)）和培養(yang) 基（例如Leibovitz L-15）用於(yu) 為(wei) 細胞提供維持其生理功能所必需離子和其他輔助因子。用於(yu) 活細胞成像的培養(yang) 基成分包括從(cong) 極簡單的“含鹽"溶液（例如林格氏液）到非常複雜的混合物（例如Leibovitz L-15），種類繁多。
但所有溶液都有一個(ge) 共同點，即都包含pH緩衝(chong) 液，因為(wei) 暴露在環境中之後，會(hui) 顯著改變培養(yang) 的pH（通常pH 7.2.-7.4）。在很多細胞外溶液中，pH緩衝(chong) 液通過添加10–20 mM兩(liang) 性離子有機化學品HEPES（2-[4-1-基]乙磺酸）來實現。但對於(yu) 很多細胞來說，細胞外溶液不能用HEPES或其他化學緩衝(chong) 液（例如MOPS、TES），因為(wei) 培養(yang) 基中缺乏pH緩衝(chong) 碳酸氫鹽會(hui) 對細胞造成傷(shang) 害。要解決(jue) 該問題，必須將二氧化碳輸送到細胞外溶液中（二氧化碳與(yu) 細胞外溶液接觸時，會(hui) 轉化為(wei) 碳酸氫鹽）。這可以通過兩(liang) 種方式實現：一種是不斷輸送氣態二氧化碳（通常以碳化物的形式：95%的氧氣和5%的二氧化碳）到細胞外溶液中，並不斷對細胞進行換液。這種方法通常用於(yu) 代謝周轉率高於(yu) 細胞增殖的切片製備。
另一種常見的方法是將細胞保存在可調節培養(yang) 環境氣體(ti) 濃度和溫度（在很多情況下）的培養(yang) 室中。在此類培養(yang) 物中持續供應5-7%的二氧化碳氣體(ti) ，並且可以嚴(yan) 格控製溫度。必須根據使用的樣品類型和實驗的持續時間，來確定化學緩衝(chong) 的細胞外溶液是否足以使細胞保持良好狀態，或者是否需要輸送二氧化碳甚至使用培養(yang) 小室。在很多情況下，化學緩衝(chong) 溶液即可滿足細胞培養(yang) 和短時實驗的要求。，因為(wei) 急性切片代謝周轉率要高得多，通常需要足夠的二氧化碳供應。但對於(yu) 很多細胞類型和長時間成像實驗，必須使用培養(yang) 小室。
 
光毒性
使用熒光染料進行活細胞成像的另一個(ge) 問題是：激光或高強度電弧放電燈的入射光會(hui) 損害細胞，即所謂的光毒性。光毒性主要在合成熒光染料被激發時發生。熒光染料被激發後，它們(men) 將與(yu) 分子氧發生反應並產(chan) 生自由基。為(wei) 避免光毒性，必須選擇盡可能低的光強度和盡可能短的激發持續時間，以將入射高能光劑量保持在盡可能低的水平。在實驗設計過程中，還必須考慮實驗的持續時間。長時間實驗中，通常不需要高幀速率。因此，圖像采集的周期頻率通常可以從(cong) 例如每秒10多幀降低到每秒1幀甚至更低。這將顯著降低樣品上的入射光劑量，從(cong) 而大幅降低光毒性。
對於(yu) 低強度熒光信號成像，可以考慮更改圖像采集條件設置，比如在大多數情況下，通過將相機功能用作像素合並或提高增益，甚至使用特殊的高靈敏度相機（例如EM-CCD相機）進行成像。這樣可以在不增加激發持續時間或光強度的情況下實現更好的信噪比和信號質量，而這兩(liang) 者都會(hui) 導致更高的光毒性。此外，選擇具有長激發波長的熒光基團也可降低光毒性，因為(wei) 與(yu) 具有短激發波長的熒光基團相比，傳(chuan) 遞給樣品的能量更低。熒光蛋白（例如綠色熒光蛋白(GFP)）的光敏位點位於(yu) 被多肽包膜覆蓋的蛋白質內(nei) 部，因此通常沒有光毒性。
 
焦麵漂移
此外，在長時間的活細胞成像實驗中，很可能發生焦麵漂移的問題，，。可以使用配備有軟件或硬件控製自動對焦的成像儀(yi) 器來避免這種情況。

 
圖5：接種了豇豆花葉病毒(CPMV)的豇豆初生葉(Vigna unguiculata "California Blackeye")，在病毒RNA 2中的運動蛋白(MP)和衣殼蛋白(CP)之間的插入GFP基因。GFP以遊離蛋白的形式大量表達（因此未融合於(yu) MP或CP），並且可以定位在受感染的表皮和葉肉細胞的細胞質和細胞核中。由荷蘭(lan) 瓦赫寧根農(nong) 業(ye) 大學，生物分子科學部門分子生物學實驗室的Joan Wellink博士及植物科學部門病毒學實驗室的Jan van Lent博士提供。
 

 
視頻1：用DIOC6染色的活洋蔥球細胞，同時進行透射光檢測；使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP2 AOBS RS拍攝，63倍物鏡，1.5倍變焦，2倍線平均，掃描分辨率512 x 265，速度每秒4.7幀。

 
視頻2：用表達GFP融合蛋白的構建體(ti) 瞬時轉染的COS細胞。細胞溶質蛋白在細胞中呈針狀分布。3D堆棧(10.14 µm，14層切)每5秒記錄一次，，持續10分鍾。本視頻使用了堆棧的最大投影。512 x 512像素，雙向掃描，變焦2倍，物鏡HCX APO L U-V-I 63.0 x 0.90 W UV。由法國伊爾基希細胞生物學研究所成像中心Jocelyn Laporte,提供。
 
用於(yu) 活細胞成像的方法
可應用於(yu) 活細胞成像的寬場和共聚焦顯微技術的範圍也非常廣泛。通常，使用複式顯微鏡和反差對比方法（例如相差和微分幹涉相差（DIC）），隨時間觀察細胞的生長、聚集或運動過程。此外，通常使用體(ti) 視顯微鏡或宏觀鏡對大型標本（例如發育中的斑馬魚胚胎）進行延時成像。在過去數十年中，先進熒光技術變得越來越重要。共聚焦顯微鏡應用的迅速增加，使生物研究的視角從(cong) 平麵向三維立體(ti) 轉變。