捕捉神經遞質受體和離子通道

中樞神經係統中的神經遞質受體(ti) 和離子通道位於(yu) 神經元突觸前後的膜室和突觸外膜室內(nei) 。這些蛋白質的激活對突觸融合和調節遞質釋放的影響取決(jue) 於(yu) 它們(men) 相對於(yu) 突觸的精確位置，以及分子在細胞微隔室的密度大小和耦合效應。因此，對膜約束受體(ti) 和離子通道進行高分辨率的定性與(yu) 定量的可視化研究，對於(yu) 理解它們(men) 在細胞通訊中發揮的作用至關(guan) 重要。

神經係統的學習(xi) 能力和環境適應能力表明，從(cong) 動力學角度而言，神經元具有改變其連接數量、類型和強度的基本能力。這些連接被稱為(wei) 突觸，是突觸後神經元和突觸前末梢之間高度有序的接點。特化的突觸膜包含大量分子，如受體(ti) 、離子通道和相關(guan) 結構蛋白，其中精確的亞(ya) 細胞結構對其發揮正常功能具有促進作用。大量研究表明，這些蛋白質的位置和它們(men) 相對於(yu) 突觸的位置都會(hui) 對其功能作用產(chan) 生實質性影響。神經遞質受體(ti) 位於(yu) 神經元突觸後區的突觸膜上，直接接觸釋放的神經遞質。

因此，受體(ti) 瞬時激活，迅速產(chan) 生突觸後反應，與(yu) 突觸前動作電位之間具有精確的鎖時關(guan) 係。相反，位於(yu) 突觸外質膜上的受體(ti) ，遠離突觸點，被溢出的神經遞質激活，產(chan) 生抑製性電導，該電導與(yu) 單個(ge) 突觸前動作電位之間並不存在精確的鎖時關(guan) 係，而是以較慢的速度反映整體(ti) 網絡活動[1]。受體(ti) 也可位於(yu) 突觸前，要麽(me) 位於(yu) 軸突末梢的突觸外膜上，要麽(me) 位於(yu) 突觸前網格上，由相同或相鄰的突觸扣結釋放出的神經遞質所激活。與(yu) 神經遞質受體(ti) 一樣，離子通道也位於(yu) 神經元的樹突膜和軸突末梢上。突觸後通道通常在突觸輸入的融合與(yu) 可塑性方麵發揮作用，並通過介導緩慢的抑製性突觸反應，增強靜息膜電位，來控製神經元興(xing) 奮。

集中於(yu) 突觸前活性區或位於(yu) 突觸扣結外膜的突觸前離子通道參與(yu) 調節神經遞質的釋放，從(cong) 而在神經元活動的突觸前調節中發揮作用。因此，很容易理解，同一受體(ti) 和離子通道針對細胞的不同亞(ya) 細胞區室時可以滿足不同的功能要求 [1]。

此外，膜蛋白激活對突觸融合與(yu) 調節遞質釋放所產(chan) 生的影響，主要取決(jue) 於(yu) 受體(ti) 和離子通道在靶神經元區室的密度大小和功能耦合，膜蛋白激活對受體(ti) 和離子通道相對於(yu) 興(xing) 奮性和抑製性突觸點所處位置的影響也是同理。因此，問題在於(yu) 如何在高分辨率下精準確定這些分子的亞(ya) 細胞位置。

為(wei) 此，下列先進的高分辨率免疫細胞化學方法已得到廣泛應用：

（1）在包埋前免疫膠體(ti) 金法中，一個(ge) 0.8nm或1.4nm的金顆粒與(yu) 二抗發生耦合反應，從(cong) 而促進適當的滲透。隨後采用銀強化法，對金顆粒進行強化，生成大小足以被檢測的顆粒。

由於(yu) 這種方法生成了非擴散性標記，因此可以確定發生反應的精確位置以及蛋白質在突觸外和突觸周圍所處的位置。然而，我們(men) 無法利用這種方法檢測突觸蛋白，原因可能在於(yu) 固定組織的特化突觸結構中的抗原表位難以確定[2]。

（2）包埋後免疫膠體(ti) 金法解決(jue) 了包埋前技術存在的問題。該方法使免疫化學品與(yu) 暴露在超薄切片表麵的抗原發生反應，隨後采用與(yu) 檢測非突觸分子相同的靈敏性檢測法來檢測突觸蛋白。這種方法還改善了蛋白質密度的定量評估。

但是，在樹脂包埋切片中，大量蛋白質掩藏，無法確定抗體(ti) ，如此便限製了這種技術的檢測靈敏度[2]。

（3）在SDS-FRL技術中，我們(men) 先用高壓冷凍儀(yi) （徠卡EM ICE）對腦組織進行冷凍，然後使用複型儀(yi) （徠卡EM ACE900）對冷凍樣本進行冷凍斷裂。蛋白質會(hui) 被分配到質膜的原生質麵（P麵）或外質麵（E麵）。將分子固定在薄碳層（3-5nm）上，再進行2nm厚的鉑/碳層鍍膜，遮住膜麵，然後用15-20nm厚的碳沉積物強化這種材料[3]。與(yu) 傳(chuan) 統的免疫膠體(ti) 金法相比，SDS-FRL技術有兩(liang) 個(ge) 主要優(you) 勢。

首先，SDS-FRL技術的靈敏度大大高於(yu) 包埋前和包埋後技術，因為(wei) 膜蛋白暴露於(yu) 複型品的二維表麵（圖1），使其很容易接觸到免疫試劑。此外，SDS會(hui) 使抗原表位發生變性，讓適合進行免疫印跡解析的抗體(ti) 與(yu) 固定在複型膜上的蛋白質發生相似反應。其次，我們(men) 可以同時觀察到突觸蛋白質和突觸外蛋白質，並且可以在膜段中實現免疫膠體(ti) 金密度的量化。

與(yu) 其他方法一樣，這種免疫細胞化學法也有一定局限性。首先，我們(men) 很難識別標記的形態結構，因此，有必要使用標記蛋白，從(cong) 而有助於(yu) 識別經過斷裂的膜[6]。其次，我們(men) 無法預測膜蛋白會(hui) 分離到P麵還是E麵：有些蛋白優(you) 先分到P麵，如GABA（B1）、Kir3.2[4]，或分到E麵，如AMPA受體(ti) [5]，而其他蛋白，如gluRδ2[6]，則同時定位於(yu) 兩(liang) 個(ge) 麵。因此，進行定量研究應仔細檢查分子的分配。

參考文獻

1. Farrant M, Nusser Z: Variations on an inhibitory theme: phasic and tonic activation of GABA(A) receptors. Nature Rev Neuroscience 6:3 (2005) 215–229.

2. Lujan R, Nusser Z, Roberts JDB, Shigemoto R, Somogyi P: Perisynaptic location of metabotropic glutamate receptors mGluR1 and mGluR5 on dendrites and dendritic spines in the rat hippocampus. Eur J Neuroscience 8:7 (1996) 1488–1500.

3. Fukazawa Y, Masugi-Tokita M, Tarusawa E, Hagiwara H, Shigemoto R: SDS-digested freezefracture replica labeling (SDS-FRL), in: Handbook of Cryo-preparation Methods for Electron microscopy, eds. Cavalier A, Spehner D, Humbel BM; CRC Press, New York (2009) 567–586.

4. Kulik A, Vida I, Fukazawa Y, Guetg N, Kasugai Y, Marker CL, Rigato F, Bettler B, Wickman K, Frotscher M, Shigemoto R. Compartment-dependent colocalization of Kir3.2-containing K+ channels and GABAB receptors in hippocampal pyramidal cells. J Neuroscience 26:16 (2006) 4289–4297.

5. Masugi-Tokita M, Tarusawa E, Watanabe M, Molnar E, Fujimoto K, Shigemoto R: Number and density of AMPA receptors in individual synapses in the rat cerebellum as revealed by SDS-digested freeze-fracture replica labeling. J Neuroscience 27:8 (2007a) 2135–2144.

6. Masugi-Tokita M, Shigemoto R: High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr opinion in Neurobiology 17 (2007b) 387–393.

7.Fujimoto K: Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Journal of Cell Science 108 (1995) 3443–3449.