使用MARS受激拉曼探針和組織透明化技術實現組織多靶標三維立體成像

在組織中研究多種蛋白質的空間位置關(guan) 係，尤其是在三維組織中，在相當多的生物醫學研究中都有非常重要的意義(yi) 。但是熒光多重標記技術存在諸多限製，並且目前能實現多重標記的方法都隻支持使用薄的組織切片（<100μm）。這篇文章的研究者利用了受激拉曼光譜成像檢測光譜比較窄，不易產(chan) 生信號串擾的優(you) 點，在透明化組織成像中引入了特殊的地中海拉曼探針，對厚達1mm的組織進行了一次性多靶標成像。
受激拉曼顯微技術檢測光譜比較窄、信號不容易產(chan) 生串擾，但是其信號比傳(chuan) 統的熒光信號強度弱，常規方法很難檢測到。研究者結合電子預共振光譜（electronic pre resonance spectroscopy）和受激拉曼顯微技術（Stimulated Ramen Scattering microscopy）,可以使染料的拉曼吸收截麵增加1013倍，彌補了拉曼信號弱、很難檢測的缺點。研究者設計了地中海拉曼檢測探針（MARS）結合優(you) 化的透明化技術（rDISCO: Raman 3D imaging of solvent -cleared organs），達到了在1mm厚的組織上11種靶標的同時成像。 
首先，研究者設計了地中海拉曼探針MARS。MARS探針使用π形連接的三鍵產(chan) 生電子放大，可以使染料的拉曼吸收截麵增加1013倍，彌補了拉曼信號弱、很難檢測的缺點。在生物細胞中MARS受激拉曼檢測光譜為(wei) 1800-2300cm-1。因為(wei) 所有的透明化試劑在2000-2400cm-1光譜範圍內(nei) 都不產(chan) 生信號，所以沒有背景。NHS Ester是常用可以和探針結合的活性基團，已知有4種已經連接了NHS Ester 的MARS探針，研究者新研發了另外四種與(yu) NHS Ester 連接的MARS探針，它們(men) 和已知的四種地中海拉曼探針在核心原子、環狀結構數量、與(yu) 氮原子的結合方式上存在差異。圖1顯示了它們(men) 的化學結構和光譜特性。

圖 2 c tubulin成像 d 免疫熒光和SRS圖像的比較 g 薄腦片的12種靶標同時成像。
Fluorescence: DNA (DAPI), vesicular glutamate transporter 1 (VGluT1-Alexa Fluor 488, glutamatergic neurons, direct immunolabeling), tyrosine hydroxylase (TH-Alexa Fluor 594, dopaminergic neurons, direct immunolabeling) and F-actin (Phalloidin-Alexa Fluor 647); epr-SRS: neuronal nuclei (NeuN; neurons, MARS2228), α-tubulin-MARS2176 (direct immunolabeling), calbindin (CB;
Purkinje neurons, MARS2145), β-III-tubulin (TUBB3; neurons, MARS2200), wheat germ agglutinin (WGA; MARS2242), GABA (γ-aminobutyric acid) B receptor 2 (GABBR2; GABAergic neurons, MARS2212), myelin basic protein (MBP; oligodendrocytes, MARS2188) and GFAP (astrocytes and neural stem cells, MARS2159).
使用這些MARS探針和抗體(ti) 結合後，可以對組織內(nei) 不同的蛋白質進行成像。與(yu) 傳(chuan) 統的免疫熒光圖像類似（圖2c）。這種方法可用於(yu) 石蠟和冰凍組織切片的成像。將MARS探針連接lectin就可以看到細胞的膜結構，因為(wei) 探針的檢測光譜很窄，隻有12 cm-1，這樣就可以實現多個(ge) 不同的拉曼探針同時成像。因此，研究者在小鼠腦切片上標記了12種marker（8種MARS和4種熒光，圖2g）,可以識別出腦片中的不同細胞，包括神經元顆粒細胞、星形膠質細胞、單樹突細胞等。

圖3 各種透明化方法的SRS成像效果，其中uDISCO方法的信號最好

圖4  Volumetric immuno-eprSRS imaging with uDISCO clearing.
a, Volume-rendered image of NeuN (granular neurons) labeled with C-cored MARS2228 in 500-μm-thick cerebellum sections cleared by uDISCO. Single-plane images show good epr-SRS contrast along the whole depth. b, One-shot eight-target volume-rendered images of a 500-μm-thick mouse cerebellum section by RADIANT. A typical workflow for tissue sample preparation, staining and clearing is depicted; Ab, antibody. Fluorescence: LEL (Lycopersicon esculentum lectin DyLight 488), TO-PRO-3 (TO-PRO; cell nucleus stain); epr-SRS: NeuN (MARS2228), TUBB3 (MARS2200), MBP (MARS2176), GABBR2 (MARS2145), WGA (MARS2242) and GFAP (MARS2159). c, Representative single-plane images with zoom-in images at z = 250 μm from the 3D data set in b; scale bars, 100 μm.
研究者還測試了不同的組織透明化方法 scale S、FOCM、Ce3D、3DISCO、 uDISCO等方法對於(yu) 40-100μm厚組織切片的成像效果，發現uDISCO的成像效果好（圖3）。並且一次對8種目標（6種MARS探針和兩(liang) 種熒光）進行了同時成像（圖4b）。
研究者還發現了透明化組織SRS成像最重要的影響因素，就是MARS探針在透明液中會(hui) 產(chan) 生降解。因此減少其降解，例如降溫到4度或者在透明液中加入DPE和VIT E等還原劑就可以提高成像效果。研究者對一係列透明化方法進行了優(you) 化和篩選，最終發現BABB-D4+1%PG在4度下成像的效果佳，並將這種方法命名為(wei) rDISCO （Raman 3D imaging of solvent -cleared organs）。在100μm的組織中，rDISCO成像的信噪比是uDISCO的2.6倍。

圖5 Volume-rendered images of GFAP (astrocytes, labeled with MARS2145) and MBP (oligodendrocytes, labeled with Alexa Fluor 488) in 1-mm-thick cerebellum sections cleared by rDISCO. Two-color merged single-plane images show good epr-SRS and fluorescence contrast along the whole depth. g, Zoomed-in, volume-rendered images of GFAP (labeled with MARS2145) in 1-mm-thick cerebellum sections cleared by rDISCO. h, Single-plane images of g at 500-μm depth show fine spatial resolution to resolve fibral structures of astrocytes .Left, zoom-in to the regions outlined by the dashed white box.1-mm-thick samples (n = 3 ROIs).
用這種方法在1mm厚的腦片上實現了11個(ge) 靶標的3D大樣本深度成像，如圖6。

圖6 RADIANT with rDISCO clearing enables millimeter-scale, highly multiplexed protein imaging.
Eleven-target volume-endered images of a 1-mm-thick mouse cerebellum section by RADIANT with rDISCO clearing. Fluorescence: concanavalin A (ConA, Alexa Fluor 350), Griffonia simplicifolia lectin (GS-II, Alexa Fluor 488), TUBB3 (Alexa Fluor 594, direct immunolabeling), TO-PRO (cell nucleus stain); epr-SRS: NeuN (MARS2228), LEL(MARS2200), MBP (MARS2176), GABBR2 (MARS2145), WGA (MARS2242), vimentin (Vim, MARS2212) and GFAP (MARS2159).
 
這項研究結合了電子預共振光譜（electronic pre resonance spectroscopy）和受激拉曼顯微技術（Stimulated Ramen Scattering microscopy），利用特殊設計的MARS探針和優(you) 化的組織透明化方法實現了在1mm腦片的11種靶標的一次性成像。這項技術在未來的生物醫學上會(hui) 有非常廣闊的應用前景。
Leica STELLARIS CRS 係統是一套方便快捷的多模態受激拉曼光譜成像係統，商品化的受激拉曼成像係統，無需為(wei) 了保證光路的正確而花很多時間去調整它，您可以專(zhuan) 注於(yu) 生物學成像，係統同時兼顧了受激拉曼成像、單光子、多光子、二次諧波、三次諧波成像，對於(yu) 上述的組織三維多靶標受激拉曼成像是非常適合的研究工具。