CLEM：整合光學電子顯微鏡優勢

20世紀90年代出現的綠色熒光蛋白（GFP）激發了人們(men) 此後對活細胞成像研究的濃厚興(xing) 趣。而顯微鏡上配備的更快捷、更靈敏的檢測裝置則讓這種研究興(xing) 趣愈發濃厚。生命科學從(cong) 這些活細胞成像研究中獲取了大量的研究成果，很難想象要是沒有這些用具，生命科學將走向何種地步。

電子顯微鏡領域並未緊跟光學顯微鏡掀起的研究熱潮，但近年來有跡象表明光學顯微鏡的分辨率有時給人們(men) 解答科學疑問帶來了局限性。因此，人們(men) 愈發有意開發能將綠色熒光蛋白的活細胞成像功能和電鏡的高分辨率有效結合的新技術（見圖1）。綠色熒光蛋白在電鏡（電子顯微鏡）中並非直接可見，但可以通過抗體(ti) 或光轉化顯現。

但這類方法隻能用於(yu) 在室溫下化學固定的樣本。有明確記錄表明這種做法會(hui) 引入人工產(chan) 物。這些人工產(chan) 物在光鏡（光學顯微鏡）下不可見，原因可能是缺少固定劑（實時），或者在研究固定樣本時人工產(chan) 物不在光鏡的分辨率範圍內(nei) 。

然而人工產(chan) 物在電鏡下則顯而易見，這種成像能力正是我們(men) 在研究超微結構時需要的高分辨率和精確細節。另外一種依靠物理固定的方法叫做冷凍固定。這種方法能更快固定細胞，並且和化學固定不同，這種方法並非選擇性固定。高壓冷凍（HPF）如今是冷凍固定細胞和組織可靠的方法。將樣本置於(yu) 高壓下（2,000bar），數毫秒後在樣品上噴灑液氮。這樣做能避免冰晶形成和擴散，並立即固定樣本，形成厚度可達200至300微米保存完好的玻璃化樣本。

高壓冷凍設備最初並非是為(wei) 這些類型的實驗設計的，主要的限製在於(yu) 在光鏡下研究樣本、發現特殊的稀有現象並將樣本轉移到高壓冷凍設備進行固定這一過程所需的時間。對一名老練的技術員來說，這一過程至少需要30秒以上。到那時，想要觀察的結構可能早已發生變化或者消失（見圖1）。

於(yu) 是，徠卡顯微係統聯手來自英國布裏斯托沃克大學醫學院的Paul Verkade博士著手開發一種能夠進行光鏡/電鏡關(guan) 聯實驗，同時支持高壓冷凍技術且時間分辨率少於(yu) 5秒的儀(yi) 器。這項開發成果便是Leica EM PACT2 /新版Leica EM ICE（見圖2）。該儀(yi) 器可自由移動，能移動到任何光學顯微鏡所在位置。RTS指的是快速傳(chuan) 輸係統該係統由快速樣品托和傳(chuan) 輸係統本體(ti) 組成，快速裝載機用於(yu) 裝載樣品（見圖3），傳(chuan) 輸係統本體(ti) 則固定在高壓冷凍設備上。待快速樣品托插入快速傳(chuan) 輸係統後，樣本被自動圍住，並沿軌道快速傳(chuan) 送至內(nei) 部進行冷凍。這個(ge) 過程僅(jin) 需2.4秒。這讓科學家有足夠時間將快速樣品托從(cong) 光學顯微鏡下取出並放入快速傳(chuan) 輸係統。這一動作可在1至1.5秒內(nei) 輕鬆完成，繼而將時間分辨率總體(ti) 維持在4-5秒左右。然後便可對冷凍樣品做電子顯微鏡觀察處理。

多數情況下，這一過程會(hui) 涉及冷凍替換。冷凍替換是指清除樣品中的冷凍水和丙酮等溶劑，然後在低溫下進行樹脂滲透和聚合。為(wei) 此，徠卡顯微係統近期推出了配備EM FSP的Leica EM AFS2，它能自動替換所有冷凍替代化學物，簡化科學家的工作。圖3是該實驗示例。表皮生長因子（EGF）與(yu) 量子點偶聯。量子點能產(chan) 生熒光且電子密度高，是光鏡/電鏡關(guan) 聯研究中非常好用的標記。表皮生長因子內(nei) 化30分鍾後出現在多泡體(ti) （MVB）中。多泡體(ti) 以動態結構出現，具有許多延伸部分並隨時間顯現和消失（見圖3c）。