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如何對細胞培養進行快速正確的檢測
本文介紹了對培養(yang) 貼壁細胞係進行傳(chuan) 代的一般工作流程及步驟說明。哺乳類細胞體(ti) 外培養(yang) 是在癌症、藥物開發、組織工程、幹細胞、疾病細胞和分子生物學等生物醫學研究領域進行臨(lin) 床和藥物研究的重要模型。要想成功維持細胞係，需要通過控製生長條件來維持細胞生理和表型的穩定性。定期監測細胞生長，對細胞進行傳(chuan) 代培養(yang) 以確保連續性。
背 景
哺乳類細胞培養(yang) 對臨(lin) 床和藥物研究與(yu) 應用至關(guan) 重要，其可用於(yu) 構建靈活的健康和疾病模型係統。例如在機能研究可支持電腦模擬分析並可用於(yu) 替代動物模型。
細胞增殖取決(jue) 於(yu) 細胞類型（從(cong) 動物組織分離的原代細胞、胚胎幹細胞、自我更新細胞、穩定永生化細胞係、轉化細胞）和培養(yang) 條件（培養(yang) 基、2D/3D細胞外基質、溫度、PH值、CO2/O2濃度）。在最佳培養(yang) 條件下可以培養(yang) 出用於(yu) 各種實驗分析的細胞。隨著動物細胞培養(yang) 技術的進步，細胞係逐步演變並被用於(yu) 疫苗生產(chan) 、治療性蛋白、藥物製劑和抗癌製劑。
要想成功維持哺乳類細胞係，必須在受控條件下培養(yang) 細胞並使用特定培養(yang) 基。此外，為(wei) 保證細胞生理和表型的穩定性，必須定期監測細胞生長狀況。通常情況下，當細胞匯合度達到80%左右，須對細胞進行傳(chuan) 代培養(yang) ，以確保細胞生長良好且健康。細胞匯合度達80%指的是培養(yang) 皿80%的表麵被細胞所覆蓋。注意：傳(chuan) 代培養(yang) 細胞的最佳匯合度取決(jue) 於(yu) 細胞類型且可能還需優(you) 化。
本篇文章描述了傳(chuan) 代培養(yang) 貼壁細胞係的一般工作流程並附上步驟說明和詳細圖解（見圖2）。
為(wei) 何需要對細胞進行傳(chuan) 代？
培養(yang) 的細胞不可能無限生長，原因在於(yu) 在有限的空間內(nei) 細胞數量不斷增多，營養(yang) 物質消耗，有毒代謝物增多最終導致細胞死亡。此外，研究人員通常需要重複實驗，因此需要對培養(yang) 細胞進行削減或擴增。經過傳(chuan) 代後細胞能生成相比原先密度更低的新細胞。去掉舊的培養(yang) 基，將細胞轉移至新鮮培養(yang) 基和基質中，補充新鮮營養(yang) 物質並清除有毒代謝物能夠長期維持培養(yang) 細胞。一開始接種細胞後，細胞生長進入遲滯期然後是對數生長期，此時細胞呈指數增殖，接著進入靜止期，此時細胞生長率和死亡率持平。（見圖1）。進入衰亡期，細胞因缺乏營養(yang) 物質或培養(yang) 條件不充足而死亡，例如細胞因匯合度過高開始爭(zheng) 奪生存空間。
圖1：細胞生長曲線：培養(yang) 細胞的生長曲線包含四個(ge) 階段：生長開始前的潛伏期（遲滯期）、指數增長期（對數生長期）、靜止期（細胞增殖速度逐漸減慢）、衰亡期（細胞因缺乏營養(yang) 物質以及生存環境有問題而死亡）。應在對數生長期更換培養(yang) 基並在進入靜止期前對細胞進行傳(chuan) 代培養(yang) 。
要使細胞處於(yu) 最佳培養(yang) 條件且維持活躍增長，有必要更新培養(yang) 基並定期進行傳(chuan) 代培養(yang) 。可根據細胞類型在對數生長期多次更換培養(yang) 基。傳(chuan) 代培養(yang) 的最佳時間位於(yu) 對數生長期和靜止期之間，在細胞達到密集狀態前進行。
為(wei) 何需要檢查細胞？
每日以及在傳(chuan) 代培養(yang) 前檢查細胞培養(yang) 物非常重要，以此監測細胞健康狀況、檢查汙染情況、確定細胞分離時間。首先用肉眼檢查培養(yang) 基中是否出現真菌汙染、培養(yang) 基渾濁度和顆粒情況，以及通過培養(yang) 基的顏色變化發現意外的pH值變化。首先用肉眼檢查培養(yang) 基中是否出現真菌汙染、培養(yang) 基渾濁度和顆粒情況，以及通過培養(yang) 基的顏色變化發現意外的pH值變化。之後應使用倒置顯微鏡近距離檢查細胞整體(ti) 形態和生長模式。倒置顯微鏡的光學元件位於(yu) 樣本下方。由於(yu) 細胞附著在培養(yang) 皿底部，從(cong) 底部視角便於(yu) 觀察。由於(yu) 正常明場照明下難以觀察到大多數細胞，因此應在100至200倍的總放大倍數和相差下進行觀察[1]。
哺乳類細胞有很多種形態，但培養(yang) 出的哺乳類細胞大多可分為(wei) 3類：成纖維細胞【中國倉(cang) 鼠卵巢（CHO）細胞】、上皮樣細胞【人類子宮頸（HeLa）細胞】以及淋巴樣細胞【人類白血病（HL60）細胞】。此外，某些細胞係具有特定的形態特征，例如神經細胞（SH-SY5Y）具有很長的樹突。細胞形態還受細胞生命周期活動影響。在有絲(si) 分裂過程中，許多細胞變得更圓，形成可在培養(yang) 基中漂浮的高折射性發亮球體(ti) 。死亡細胞的細胞膜完整性發生變化，細胞變得更圓，貼壁細胞從(cong) 生長表麵分離。在顯微鏡下，死亡細胞通常不會(hui) 發亮及產(chan) 生折射，它們(men) 通常的細胞膜形態可能會(hui) 發生改變
不同細胞係不僅(jin) 尺寸和形狀不同，生長特性也有所不同。它們(men) 要麽(me) 發展成貼壁細胞（成纖維細胞和上皮細胞），要麽(me) 發展成懸浮細胞（淋巴樣細胞）。大多數貼壁細胞係會(hui) 生成單細胞層，附著在玻璃或經處理的塑料基板上（例如塗有聚賴氨酸、纖連蛋白、膠原蛋白或明膠）。
如何傳(chuan) 代培養(yang) 細胞？
最常見的傳(chuan) 代細胞製備方法是使用胰蛋白酶等蛋白水解酶分解細胞間及細胞與(yu) 培養(yang) 基之間的黏合。胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的共同作用使細胞從(cong) 生長表麵脫離。胰蛋白酶切斷將細胞固定在培養(yang) 皿上的黏著斑，乙二胺四乙酸則作為(wei) 鈣螯合劑。
根據細胞類型或下遊實驗也可使用其他蛋白酶代替胰蛋白酶，如天然膠原酶或合成消化雞尾酒溶液等。
將參與(yu) 細胞間相互作用的鈣粘蛋白中的鈣成分去掉，從(cong) 而分解鈣粘蛋白，將細胞分離開來。細胞一旦失去與(yu) 生長表麵和周圍細胞的黏合，就能輕易分離並在新的細胞培養(yang) 皿中生長。細胞一旦失去與(yu) 生長表麵和周圍細胞的黏合，就能輕易分離並在新的細胞培養(yang) 皿中生長。圖2描述了傳(chuan) 代培養(yang) 工作流程的基本步驟。在整個(ge) 傳(chuan) 代培養(yang) 過程中重要的是，要在無汙染環境下工作。在傳(chuan) 代培養(yang) 初始階段、胰蛋白酶分解過程中、細胞計數環節以及細胞分離後都要檢查細胞狀況。保持正確記錄和歸檔對於(yu) 獲得一致結果和實驗追溯同樣非常重要。
圖2：傳(chuan) 代培養(yang) 工作流程中標紅的步驟表示需要使用顯微鏡檢查。
以下實驗計劃給出了狗腎髒細胞在90mm有蓋培養(yang) 皿中進行傳(chuan) 代培養(yang) 的基本原則。這些細胞是從(cong) 狗的遠端小管上分離的上皮細胞。在培養(yang) 過程中，細胞貼壁生長，在實現匯合後形成由多邊形細胞構成的單細胞層。
需要以下材料和設備：
材料：
培養(yang) 基預熱至 37° C（狗腎髒細胞需要：MEM培養(yang) 基加5%FCS胎牛血清、2mM穀氨酰胺、100 U/mL青黴素、100 mg/mL鏈黴素）；
預熱不含鈣鎂的PBS緩衝(chong) 液；
在D-PBS緩衝(chong) 液中預熱0.05%的胰蛋白酶、0.02%的乙二胺四乙酸；
台盼藍（活體(ti) 染劑）；以及
消毒用的70%乙醇或異丙醇。
當進行無動物源或成分明確的細胞培養(yang) 時，使用無血清培養(yang) 基、FBS/FCS合成替代品及非動物性解離劑。
設備：
帶一次性吸頭的細胞計數室移液管或微量移液管；
支持相差功能的倒置顯微鏡（DMi1，Mateo TL）；
防護服和材料；
溫度適宜的水浴槽；
37°C、含5% CO2、濕度高的培養(yang) 箱；
離心機；
離心管；
事先標注的培養(yang) 皿。
狗腎髒細胞的傳(chuan) 代比例應為(wei) 1:10。根據細胞類型調節比例。例如原代細胞培養(yang) 物、永生化細胞係、胚胎幹細胞等可能具有不同的最佳比例。
使用徠卡DMi1傳(chuan) 代培養(yang) 貼壁細胞的4步工作流程
步驟1
細胞檢查
從(cong) 培養(yang) 箱中取出細胞並放在顯微鏡下快速檢查。應每天進行顯微鏡檢查，確保細胞處於(yu) 健康狀態（無汙染、死亡細胞少）並按預計生長。
在培養(yang) 貼壁細胞時，細胞應主要附著在培養(yang) 皿活燒瓶底部，培養(yang) 基應呈粉橙色。由於(yu) 培養(yang) 基中細胞代謝物（或汙染）導致酸化，因此酸堿指示劑酚紅呈黃色。由於(yu) 培養(yang) 基中細胞代謝物（或汙染）導致酸化，因此酸堿指示劑酚紅呈黃色。在正常明場照明下難以觀察到這些細胞。切換至相差可以使細胞更容易被觀察到。如圖所示，使用DMi1，隻需移動聚光鏡環的滑塊即可選擇相差。
記錄細胞狀態對確保各實驗結果一致十分重要。DMi1可配備攝像頭和屏幕，通過遠程控製輕鬆實現成像和保存。研究人員使用Mateo TL集成攝像頭可以拍攝細胞圖像，追蹤培養(yang) 基狀況，將圖像轉存智能設備或U盤。
比較狗腎髒細胞在明場照明和相差圖像中的顯示效果：相差圖像的概覽效果更好，更易於(yu) 檢查細胞形態和細胞計數。
步驟2
細胞提取
用移液器將培養(yang) 基吸取至廢物容器中。也可以使用接有真空吸液器的移液器。
使用5ml不含鈣鎂的預熱PBS緩衝(chong) 液仔細衝(chong) 洗細胞，衝(chong) 洗3次，去除殘留培養(yang) 基中的胎牛血清。胎牛血清及其替代物會(hui) 抑製胰蛋白酶。加入3ml預熱胰蛋白酶/乙二胺四乙酸，輕輕轉動培養(yang) 皿使其均勻覆蓋培養(yang) 皿底部的細胞。在37°C下培育幾分鍾即可傳(chuan) 代細胞。
不同細胞係需要的胰蛋白酶培養(yang) 時間不同。為(wei) 避免過度胰蛋白酶化使細胞受損，每隔幾分鍾在顯微鏡下檢查一次細胞。
輕柔地衝(chong) 洗培養(yang) 皿，並將細胞懸浮液轉移至50ml試管中，以800rpm的速度轉動5分鍾使細胞沉降下來。吸走上層清液並在10ml新鮮培養(yang) 基中重懸細胞，去除胰蛋白酶。
分離出的細胞應呈圓形並在胰蛋白酶溶液中自由漂浮。細胞一經分離，即向培養(yang) 皿中加入5ml培養(yang) 基，滅活胰蛋白酶。
步驟3
細胞計數
將100µL細胞懸浮液與(yu) 等量的0.4%台盼藍溶液混合。台盼藍選擇性滲入死亡細胞的細胞膜並將其染藍，但不會(hui) 被活細胞吸收。將蓋玻片置於(yu) 計數表麵上，準備好血球計。
將移液器吸嘴置於(yu) 蓋玻片邊緣輕輕擠出細胞懸浮液，將其滴加在計數室上（單位麵積約4µl）。蓋玻片下的整片區域發生毛細管作用。大多數情況下，計數室有兩(liang) 個(ge) 計數區可各自承接液體(ti) 。
將計數室放在顯微鏡載物台上並將焦點集中在細胞上。方形計數網格樣式依計數室類型而定。圖中所示的Fuchs-Rosenthal血細胞計數板有16個(ge) 區域，每個(ge) 區域1平方毫米，整體(ti) 被線包圍。每個(ge) 正方形區域被細分為(wei) 16個(ge) 小正方形。如圖所示，計算一個(ge) 區域內(nei) 16個(ge) 正方形中的細胞總數。為(wei) 避免重複計算位於(yu) 大正方形邊線上的細胞，僅(jin) 計算位於(yu) 正方形兩(liang) 條邊上的細胞。在本例中，觸及正方形上方和左側(ce) 標紅邊線（加粗紅線）的細胞應被計入。觸及下方和右側(ce) 紅色邊線的細胞應不被計入。計算計數室5個(ge) 1平方毫米區域內(nei) 的活細胞和死亡細胞。要計算最終結果，需要合計5個(ge) 正方形的計數結果。為(wei) 求得更精確的測算結果，也可以計算計數室其他正方形（大於(yu) 5個(ge) ）的細胞數量。
使用以下公式可計算細胞濃度：
此外還可使用細胞自動計數器。
步驟4
細胞植入
用移液器將所需細胞量（合適的細胞數量）以所需分離率（此處為(wei) 1:10）吸取至新的培養(yang) 皿中，在各培養(yang) 皿中加入所需容積的培養(yang) 基（10ml）。注意細胞類型、細胞分離日期以及培養(yang) 皿蓋子上的細胞傳(chuan) 代次數。將細胞放回37°C培養(yang) 箱中。
將細胞放置一晚，讓其恢複和沉降。24小時後使用顯微鏡檢查細胞形狀、黏著性及是否存在汙染。
細胞應附著在培養(yang) 皿底部並已開始生長和分裂。細胞應附著在培養(yang) 皿底部並已開始生長和分裂。讓細胞生長直至匯合並準備好進入實驗或開始下一輪傳(chuan) 代培養(yang) 。
參考文獻：
1.W. Ockenga, Phase Contrast: Making Unstained Phase Objects Visible, Science Lab (2011) Leica Microsystems.
