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熒光入門介紹
熒光是George Gabriel Stokes於(yu) 1852年shouci報道的一種現象。他觀察到螢石在紫外線照射後開始發光。熒光是光致發光的一種形式，是指一種材料被光照射後會(hui) 發射出光子。發射光的波長比激發光更長。這種效應又稱為(wei) 斯托克斯位移。
以熒光為工具在顯微鏡中的應用
熒光在顯微鏡中有著廣泛的應用，是觀察特定分子分布的重要工具。細胞中的絕大多數分子並不會(hui) 發出熒光，因此必須用熒光分子即所謂的熒光素進行標記。對於(yu) 感興(xing) 趣的分子可以直接標記（例如，用DAPI標記DNA），或者使用可與(yu) 特異性抗體(ti) 偶聯的熒光素進行免疫染色。免疫染色時通常必須對細胞進行固定。
熒光顯微鏡還可對活細胞或組織進行延時成像。為(wei) 此，對於(yu) 感興(xing) 趣的蛋白質可以使用基因編碼的熒光分子進行標記，如GFP（綠色熒光蛋白）。對於(yu) 感興(xing) 趣的分子（如Ca2+）還可以使用可逆結合的合成染料（如fura-2）或轉基因天然蛋白質（如GFP衍生物）進行標記。
圖1：當特定波長（激發波長）的光照射到分子上（例如照射到熒光團中）時，光子會(hui) 被分子的電子吸收。然後，電子從(cong) 它們(men) 的基態(S0)提升到更高的能級，即激發態(S1’)。這個(ge) 過程被稱為(wei) 激發(1)。激發態壽命很短(通常為(wei) 10-9/-10-8秒)，在此期間電子的一些能量會(hui) 丟(diu) 失(2)。當電子離開激發態(S1)返回基態(3)時，它們(men) 會(hui) 失去在激發過程中獲得的剩餘(yu) 能量。熒光團的獲得的能量會(hui) 以光子形式釋放，釋放的光子波長以比激發光波長更長，從(cong) 而能量更少。這種現象被稱為(wei) 斯托克斯位移。
圖2：COS 7細胞，綠色：無特征蛋白質，GFP，紅色：α-微管蛋白，Cy3，藍色：細胞核，DAPI。感謝中國上海SIBS、CAS、生物化學與(yu) 細胞生物學研究所邊瑋提供的圖片。
圖3：小鼠成纖維細胞，綠色：F-肌動蛋白，FITC，紅色：微管蛋白，Cy5，藍色：細胞核，DAPI。感謝德國海德堡Max Planck醫學研究所Günter Giese博士提供的圖片。
圖4：小鼠原代海馬神經元細胞，藍色：轉染細胞標記；綠色：肌動蛋白，TRITC；紅色：GluA Ampa受體(ti) 單位，Texas Red；灰色：突觸小泡蛋白，Cy 5
圖5：果蠅幼蟲，綠色：RNA結合蛋白，Alexa 488
磷光的機製原理
由於(yu) 磷光分子發光的時間比熒光素長得多，因此它們(men) 儲(chu) 存激發能量的方式肯定有所不同。這種差異的基礎在於(yu) 兩(liang) 種形式的激發能級，即單重激發態和三重激發態都基於(yu) 不同的自旋排列。
自旋是電子的一種屬性。簡單來說，自旋描述了由電子旋轉引起的角動量。電子的自旋方向可以是正方向（+1/2），也可以是負方向（−1/2）。更高能級的自旋配對可以在相互方向上平行或反平行。在反平行自旋配對中，單個(ge) 角動量相互補償(chang) ，同時自旋總值為(wei) 零。這種自旋排列就稱為(wei) 單重態。兩(liang) 種平行自旋互不補償(chang) 且所得數值不同於(yu) 零值，在這種情況下，自旋被稱為(wei) 三重態。
當電子從(cong) 單重態激發態回到基態時，就會(hui) 產(chan) 生熒光。但在某些分子中，被激發電子的自旋可以在一種稱為(wei) 係統間交叉的過程中轉換為(wei) 三重態。這些電子失去能量，直到它們(men) 處於(yu) 三重基態。這種態比基態具有更高的能量，但也比單重態激發態具有更低的能量。因此，電子無法切換回單重態，也不能輕易地返回基態，因為(wei) 量子力學隻允許自旋總值為(wei) 零。因此分子被困在其能量狀態當中。
但從(cong) 三重基態到基態的一些變化有時還是有可能的。這些變化會(hui) 發射出光子和磷光。由於(yu) 一次隻有少數事件可能發生，三重基態呈現為(wei) 能量儲(chu) 庫的形式，因此能夠在更長的一段時間內(nei) 發出磷光。
冷發光在顯微鏡中的應用
對於(yu) 顯微鏡，熒光是最為(wei) 實用的一種冷發光。熒光素可以很容易地通過特定的光源（如燈和濾光係統或激光器）在特定波長下激發，發射光和激發光可以通過波長來加以區分（斯托克斯位移）。
利用熒光成像，實驗室人員可以對細胞內(nei) 的分子數量和位置進行特征描述。熒光顯微鏡的另一個(ge) 優(you) 點是可以同時使用幾種熒光素。熒光素隻需其激發和發射波長不同即可。因此，不同目標分子均可同時觀察並開展大量的實驗，例如開展共定位的研究等。
圖6：果蠅，幼蟲齡期，綠色：Feb211陽性神經元及其軸突，Alexa 488；紅色：CNS纖維部分（即所有軸突），Cy3；藍色：細胞核，DAPI。感謝德國Eggenstein-Leopoldshafen毒理學與(yu) 遺傳(chuan) 基因研究所，Karlsruhe研究所Christoph Melcher博士提供的圖片。
圖7：小鼠腎髒切片，綠色：腎小球和腎曲小管，Alexa 488 WGA；紅色：F-肌動蛋白（普遍存在於(yu) 腎小球和刷狀緣）；藍色：細胞核，DAPI
圖8：新生心肌細胞，黃色：DNA，DAPI；綠色：肌間蛋白，Cy3；紅色：鈣粘蛋白，Texas Red；藍色：肌動蛋白，Alexa 633
圖9：熒光顯微鏡下獲得的分裂中期FISH染色染色體(ti) 。感謝東(dong) 京大學前沿科學研究生院人類進化實驗室Yumiko Suto博士提供的圖片。
